Formulação e modulação acústica de nanogotículas de perfluorocarbono opticamente vaporizadas
Summary
As nanogotículas de perfluorocarbono ativadas opticamente mostram-se promissoras em aplicações de imagem fora do sistema vascular. Este artigo demonstrará como sintetizar essas partículas, cruzar fantasmas de poliacrilamida e modular as gotículas acusticamente para melhorar seu sinal.
Abstract
As microbolhas são o agente de contraste de imagem mais comumente usado no ultrassom. No entanto, devido ao seu tamanho, eles são limitados a compartimentos vasculares. Essas microbolhas podem ser condensadas ou formuladas como nanogotículas de perfluorocarbono (PFCnDs) que são pequenas o suficiente para extravasar e, em seguida, serem acionadas acusticamente no local alvo. Essas nanopartículas podem ser ainda mais aprimoradas pela inclusão de um absorvedor óptico, como corante orgânico infravermelho próximo ou nanopartículas (por exemplo, nanopartículas de sulfeto de cobre ou nanopartículas/nanobastões de ouro). PFCnDs opticamente marcados podem ser vaporizados através de irradiação a laser em um processo conhecido como vaporização óptica de gotículas (ODV). Este processo de ativação permite o uso de núcleos de perfluorocarbono de alto ponto de ebulição, que não podem ser vaporizados acusticamente abaixo do limiar máximo de índice mecânico para diagnóstico por imagem. Núcleos de ponto de ebulição mais altos resultam em gotículas que se recondensarão após a vaporização, resultando em PFCnDs “piscando” que produzem brevemente contraste após a vaporização antes de condensar de volta à forma de nanogotículas. Esse processo pode ser repetido para produzir contraste sob demanda, permitindo a imagem livre de fundo, multiplexação, super-resolução e aprimoramento de contraste através de modulação óptica e acústica. Este artigo demonstrará como sintetizar PFCnDs de casca lipídica opticamente desencadeáveis utilizando sonicação de sonda, criar simuladores de poliacrilamida para caracterizar as nanogotículas e modular acusticamente os PFCnDs após ODV para melhorar o contraste.
Introduction
As microbolhas são o agente de contraste ultrassônico mais onipresente devido à sua biocompatibilidade e excelente ecogenicidade em comparação com os tecidos moles. Isso os torna ferramentas valiosas para visualizar o fluxo sanguíneo, a delimitação de órgãos e outras aplicações1. No entanto, seu tamanho (1-10 μm), o que os torna excepcionais para exames de imagem com base em sua frequência ressonante, restringe suas aplicações à vasculatura2.
Essa limitação levou ao desenvolvimento de PFCnDs, que são nanoemulsões compostas por um surfactante envolto em torno de um núcleo líquido de perfluorocarbono. Essas nanopartículas podem ser sintetizadas em tamanhos tão pequenos quanto 200 nm e são projetadas para tirar proveito da vasculatura ou poros “com vazamento” e fenestrações abertas encontradas na vasculatura tumoral. Embora essas rupturas sejam dependentes do tumor, essa permeabilidade permite o extravasamento de nanopartículas de ~200 nm – 1,2 μm, dependendo do tumor 3,4. Em sua forma inicial, essas partículas produzem pouco ou nenhum contraste de ultrassom. Após a vaporização – induzida acusticamente ou opticamente – a fase central muda de líquido para gás, induzindo um aumento de duas vezes e meia a cinco vezes no diâmetro 5,6,7 e gerando contraste fotoacústico e ultrassonográfico. Embora a vaporização acústica seja o método de ativação mais comum, essa abordagem cria artefatos acústicos que limitam a imagem da vaporização. Além disso, a maioria dos perfluorocarbonetos requer ultrassom focalizado com índice mecânico além do limiar de segurança para vaporizar8. Isso levou ao desenvolvimento de PFCnDs de menor ponto de ebulição, que podem ser sintetizados pela condensação de microbolhas em nanogotículas9. No entanto, essas gotículas são mais voláteis e sujeitas à vaporização espontânea10.
A vaporização óptica de gotículas (ODV), por outro lado, requer a adição de um gatilho óptico como nanopartículas 11,12,13 ou corante6,14,15 e pode vaporizar perfluorocarbonos de maior ponto de ebulição usando fluências dentro do limite de segurança ANSI 11. Os PFCnDs sintetizados com núcleos de ponto de ebulição mais altos são mais estáveis e se recondensam após a vaporização, permitindo imagens livres de fundo16, multiplexação 17 e super-resolução18. Uma das principais limitações dessas técnicas é o fato de que os PFCnDs de alto ponto de ebulição são ecogênicos após a vaporização por apenas um curto período de tempo, na escala de milissegundos19, e são relativamente fracos. Embora esse problema possa ser mitigado por meio de vaporizações repetidas e média, a detecção e a separação do sinal de gotículas continuam sendo um desafio.
Inspirando-se na inversão do pulso, a duração e o contraste podem ser potencializados modificando a fase do pulso de ultrassonografia19. Ao iniciar o pulso de imagem de ultrassom com uma fase de rarefação (n-pulso), tanto a duração quanto o contraste dos PFCnDs vaporizados aumentam. Em contraste, iniciar o pulso de imagem de ultrassom com uma fase de compressão (pulso-p), resulta em contraste reduzido e menor duração. Este artigo descreverá como sintetizar nanogotículas de perfluorocarbono opticamente acionáveis, simuladores de poliacrilamida comumente usados em imagens e demonstrar o aprimoramento do contraste e a longevidade do sinal aprimorado por meio da modulação acústica.
Protocol
Representative Results
Discussion
A sonicação da sonda é um método relativamente simples e fácil de aprender para fabricar PFCnDs. Existem alguns passos em que o cuidado deve ser tomado. Ao manusear clorofórmio, é imperativo que uma pipeta de deslocamento positivo ou seringas de vidro seja usada, pois é volátil e “vazará” das pipetas de deslocamento de ar padrão. Além disso, se estiver usando um deslocamento positivo, certifique-se de que uma ponta apropriada seja usada, pois o clorofórmio dissolverá a maioria das pontas plásticas, o que p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado em parte pela Breast Cancer Research Foundation sob a concessão BCRF-20-043.
Materials
| Ammonium Persulfate (APS) | VWR | 97064-592 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880120C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® | VWR | EM-1300 | acrylamide solution, lower concentration/ powder |
| IR-1048 | Sigma | 405175 | Infrared dye |
| L11-4v | Verasonics | – | ultrasound linear array transducer |
| Microtip 1/8" | Qsonica LLC | 4418 | microtip for probe sonicator |
| N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) | VWR | 97064-902 | Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate |
| Nova II | Ophir-Spiricon | 7Z01550 | laser power meter |
| Perfluorohexane | Fluoromed | APF-60M | perfluorocarbon liquid |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | VWR | 97062-732 | Tablets used to make PBS |
| Q500 | Qsonica LLC | Q500-110 | Probe sonicator |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | 288500 | 2-25 μm particle size |
| Tempest 30 | New wave research | – | Pulsed laser system |
| Vantage 128 | Verasonics | – | research ultrasound imaging system |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments Ltd | – | Makes size measurements based on dynamic light scattering |
Referências
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