Formulering og akustisk modulering av optisk fordampede perfluorkarbon nanodråper

Summary

Optisk aktiverte perfluorkarbon nanodråper viser løfte i bildebehandlingsapplikasjoner utenfor det vaskulære systemet. Denne artikkelen vil demonstrere hvordan man syntetiserer disse partiklene, kryssbinder polyakrylamidfantomer og modulerer dråpene akustisk for å forbedre signalet.

Abstract

Mikrobobler er det mest brukte bildekontrastmiddelet i ultralyd. På grunn av deres størrelse er de imidlertid begrenset til vaskulære rom. Disse mikroboblene kan kondenseres eller formuleres som perfluorkarbonnanodråper (PFCnDs) som er små nok til å ekstravasere og deretter utløses akustisk på målstedet. Disse nanopartiklene kan forbedres ytterligere ved å inkludere en optisk absorber som nær infrarød organisk fargestoff eller nanopartikler (f.eks. Kobbersulfid nanopartikler eller gull nanopartikler / nanoroder). Optisk merkede PFCnDs kan fordampes gjennom laserbestråling i en prosess kjent som optisk dråpefordampning (ODV). Denne aktiveringsprosessen muliggjør bruk av perfluorkarbonkjerner med høyt kokepunkt, som ikke kan fordampes akustisk under den maksimale mekaniske indeksgrensen for diagnostisk avbildning. Høyere kokepunktkjerner resulterer i dråper som vil kondensere etter fordampning, noe som resulterer i “blinkende” PFCnD-er som kort produserer kontrast etter fordampning før de kondenserer tilbake til nanodråpeform. Denne prosessen kan gjentas for å produsere kontrast på forespørsel, noe som gir bakgrunnsfri bildebehandling, multipleksing, superoppløsning og kontrastforbedring gjennom både optisk og akustisk modulering. Denne artikkelen vil demonstrere hvordan man syntetiserer optisk utløsbare, lipidskall PFCnDs ved bruk av sondesonikering, lager polyakrylamidfantomer for å karakterisere nanodråpene, og akustisk modulerer PFCnDs etter ODV for å forbedre kontrasten.

Introduction

Mikrobobler er det mest allestedsnærværende ultralydkontrastmiddelet på grunn av deres biokompatibilitet og utmerket ekkogenitet i forhold til bløtvev. Dette gjør dem til verdifulle verktøy for å visualisere blodstrøm, organavgrensning og andre applikasjoner¹. Imidlertid begrenser størrelsen (1-10 μm), som gjør dem eksepsjonelle for avbildning basert på resonansfrekvensen, deres applikasjoner til vaskulaturen².

Denne begrensningen har ført til utviklingen av PFCnDs, som er nano-emulsjoner sammensatt av et overflateaktivt middel innkapslet rundt en flytende perfluorkarbonkjerne. Disse nanopartiklene kan syntetiseres i størrelser så små som 200 nm og er designet for å dra nytte av “lekkende” vaskulatur eller porer og åpne fenestrasjoner som finnes i tumorvaskulatur. Selv om disse forstyrrelsene er tumoravhengige, tillater denne permeabiliteten ekstravasering av nanopartikler fra ~ 200 nm – 1,2 μm, avhengig av svulsten ^3,4. I sin opprinnelige form produserer disse partiklene liten eller ingen ultralydskontrast. Ved fordampning – indusert akustisk eller optisk – endres kjernefasen fra væske til gass, induserer en to og en halv til fem ganger økning i diameter ^5,6,7 og genererer fotoakustisk og ultralydkontrast. Mens akustisk fordampning er den vanligste aktiveringsmetoden, skaper denne tilnærmingen akustiske artefakter som begrenser avbildningen av fordampningen. I tillegg krever de fleste perfluorkarboner fokusert ultralyd med en mekanisk indeks utover sikkerhetsgrensen for å fordampe⁸. Dette har ført til utviklingen av PFCnDs med lavere kokepunkt, som kan syntetiseres ved å kondensere mikrobobler til nanodråper⁹. Imidlertid er disse dråpene mer flyktige og utsatt for spontan fordampning¹⁰.

Optisk dråpefordampning (ODV) krever derimot tilsetning av en optisk utløser som nanopartikler 11,12,13 eller fargestoff ^6,14,15 og kan fordampe perfluorkarboner med høyere kokepunkt ved bruk av fluenser innenfor ANSI-sikkerhetsgrensen ¹¹. PFCnDs syntetisert med høyere kokepunktkjerner er mer stabile og vil kondensere etter fordampning, noe som muliggjør bakgrunnsfri avbildning¹⁶, multipleksing 17 og superoppløsning¹⁸. En av de største begrensningene ved disse teknikkene er det faktum at PFCnD-er med høyt kokepunkt er ekkogene etter fordampning i bare en kort tidsramme, på skalaen millisekunder¹⁹, og er relativt svake. Selv om dette problemet kan reduseres gjennom gjentatte fordampninger og gjennomsnitt, er deteksjon og separasjon av dråpesignal fortsatt en utfordring.

Med inspirasjon fra pulsinversjon kan varigheten og kontrasten forbedres ved å endre fasen av ultralydavbildningspulsen¹⁹. Ved å starte ultralydavbildningspulsen med en sjeldenhetsfase (n-puls), øker både varigheten og kontrasten til de fordampede PFCnDs. I motsetning til dette resulterer oppstart av ultralydavbildningspulsen med en kompresjonsfase (p-puls), i redusert kontrast og kortere varighet. Denne artikkelen vil beskrive hvordan man syntetiserer optisk utløsbare perfluorkarbonnanodråper, polyakrylamidfantomer som ofte brukes i bildebehandling, og demonstrerer kontrastforbedring og forbedret signallevetid gjennom akustisk modulering.

Protocol

1. Perfluorkarbon nanodroplet formulering Skyll ut en 10 ml rundbunnskolbe med kloroform og vask ut en 10 μL og 1 ml gasstett glasssprøyte med kloroform ved gjentatte ganger å aspirere hele sprøytevolumet og utvise det totalt tre ganger.FORSIKTIG: Kloroform er flyktig og kan være giftig ved innånding. Alt arbeid med dette løsningsmidlet skal utføres i en avtrekksvifte. Bruk sprøytene til å tilsette 200 μL DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC, 25…

Representative Results

Vellykket formulering og sentrifugalseparasjon av PFCnDs skal gi dråper rundt størrelsen 200-300 nm i diameter (figur 1A). Feil separerte dråper kan vise små topper rundt 1 μm. Disse løsningene kan videre badesonikeres for å bryte opp de større dråpene. Størrelsen på dråpene vil øke over tid på grunn av koalescing og/eller diffusjon i en prosess kjent som Ostwald modning21,22 (figur 1B).</p…

Discussion

Sonde sonikering er en relativt enkel og lett å lære metode for å fremstille PFCnDs. Det er noen få skritt der det må tas hensyn. Ved håndtering av kloroform er det viktig at en pipette eller glasssprøyter med positiv forskyvning brukes, da den er flyktig og vil “lekke” fra standard luftforskyvningspipetter. Videre, hvis du bruker en positiv forskyvning, må du sørge for at en passende spiss brukes, da kloroform vil oppløse de fleste plastspisser, noe som kan introdusere forurensninger i løsningen. En pipette e…

Materials

Ammonium Persulfate (APS)	VWR	97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365C	Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG)	Avanti Polar Lipids	880120C	Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur®	VWR	EM-1300	acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048	Sigma	405175	Infrared dye
L11-4v	Verasonics	–	ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8"	Qsonica LLC	4418	microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED)	VWR	97064-902	Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II	Ophir-Spiricon	7Z01550	laser power meter
Perfluorohexane	Fluoromed	APF-60M	perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	VWR	97062-732	Tablets used to make PBS
Q500	Qsonica LLC	Q500-110	Probe sonicator
Silica gel	Sigma-Aldrich	288500	2-25 μm particle size
Tempest 30	New wave research	–	Pulsed laser system
Vantage 128	Verasonics	–	research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments Ltd	–	Makes size measurements based on dynamic light scattering