Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120
Summary
Optogenética é uma ferramenta poderosa com aplicações abrangentes. Este protocolo demonstra como alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish usando o sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul.
Abstract
Sistemas de expressão genética indutíveis são uma ferramenta inestimável para estudar processos biológicos. Sistemas de expressão optogenética podem fornecer controle preciso sobre o tempo, localização e amplitude da expressão genética usando a luz como agente indutor. Neste protocolo, um sistema de expressão optogenética é usado para alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish. Este sistema se baseia em um fator de transcrição projetado chamado TAEL baseado em um fator de transcrição ativado pela luz natural da bactéria E. litoralis. Quando iluminado com luz azul, o TAEL escurece, liga-se ao seu elemento regulatório cognato chamado C120 e ativa a transcrição. Este protocolo utiliza embriões transgênicos de zebrafish que expressam o fator de transcrição do TAEL sob o controle do onipresente promotor ubb. Ao mesmo tempo, o elemento regulatório C120 impulsiona a expressão de um gene repórter fluorescente (GFP). Usando um simples painel LED para fornecer luz azul ativante, a indução da expressão GFP pode ser detectada primeiro após 30 minutos de iluminação e atinge um pico de mais de 130 vezes de indução após 3h de tratamento leve. A indução de expressão pode ser avaliada por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e por microscopia de fluorescência. Este método é uma abordagem versátil e fácil de usar para a expressão genética optogenética.
Introduction
Sistemas de expressão genética indutíveis ajudam a controlar a quantidade, o tempo e a localização da expressão genética. No entanto, alcançar o controle espacial e temporal exato em organismos multicelulares tem sido desafiador. O controle temporal é mais comumente alcançado adicionando compostos de pequenas moléculas1 ou ativação dos promotores de choque térmico2. Ainda assim, ambas as abordagens são vulneráveis a questões de tempo, força de indução e respostas de estresse fora do alvo. O controle espacial é alcançado principalmente pelo uso de promotores específicos do tecido3,mas essa abordagem requer um promotor adequado ou elemento regulatório, que nem sempre estão disponíveis, e não é propício à indução do nível subsecimento.
Em contraste com tais abordagens convencionais, ativadores transcricionais optogenéticos ativados pela luz têm o potencial de um controle espacial e temporal mais fino da expressãogenética 4. O sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul foi desenvolvido e otimizado para uso em embriões de zebrafish5,6. Este sistema é baseado em um fator de transcrição endógeno ativado pela luz da bactéria E. litoralis7,8. O sistema TAEL/C120 consiste em um ativador transcricional chamado TAEL que contém um domínio de transativação Kal-TA4, um domínio LOV lov (sensor de tensão de luz-oxigênio) azul e um domínio de ligação de DNA helix-turn-helix (HTH)5. Quando iluminados, os domínios LOV sofrem uma alteração conformacional que permite que duas moléculas de TAEL dimerizem, vinculem-se a um promotor C120 responsivo do TAEL e iniciem a transcrição de um gene a jusante de interesse5,8. O sistema TAEL/C120 apresenta indução rápida e robusta com toxicidade mínima, podendo ser ativado por diversas modalidades diferentes de entrega de luz. Recentemente, foram feitas melhorias no sistema TAEL/C120, adicionando um sinal de localização nuclear ao TAEL (TAEL-N) e acoplando o elemento regulatório C120 a um promotor basal cFos (C120F) (Figura 1A). Essas modificações melhoraram os níveis de indução em mais de 15vezes 6.
Neste protocolo, um simples painel LED é usado para ativar o sistema TAEL/C120 e induzir a expressão onipresente de um gene repórter, GFP. A indução de expressão pode ser monitorada qualitativamente observando a intensidade da fluorescência ou quantitativamente medindo os níveis de transcrição usando PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Este protocolo demonstrará o sistema TAEL/C120 como uma ferramenta versátil e fácil de usar que permite uma regulação robusta da expressão genética in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve o uso do sistema optogenético TAEL/C120 para alcançar a expressão genética indutível da luz azul. Este sistema consiste em um ativador transcricional, TAEL, que escurece após a iluminação com luz azul e ativa a transcrição de um gene de interesse a jusante de um elemento regulatório C120. A expressão induzida de um repórter do GFP pode ser detectada após apenas 30 minutos de exposição à luz, sugerindo que essa abordagem possui cinética relativamente rápida e responsiva.
<p c…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Stefan Materna e aos membros dos laboratórios Woo e Materna por sugestões úteis e comentários sobre este protocolo. Agradecemos a Anna Reade, Kevin Gardner e Laura Motta-Mena por valiosas discussões e insights enquanto desenvolvem este protocolo. Este trabalho foi apoiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH; R03 DK106358) e o Comitê Coordenador de Pesquisa do Câncer da Universidade da Califórnia (CRN-20-636896) para s.W.
Materials
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
Referências
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