फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए मैक्रोपिनोसोम के परिमाणीकरण के लिए स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण
Summary
बहु-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट का उपयोग करके स्वचालित assays एक ही प्रयोग में स्थितियों की एक भीड़ के आकलन की अनुमति देकर मार्ग नियामकों की पहचान करने के लिए लाभप्रद दृष्टिकोण हैं। यहां, हमने अच्छी तरह से स्थापित मैक्रोपिनोसोम इमेजिंग और परिमाणीकरण प्रोटोकॉल को 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप में अनुकूलित किया है और एक बहु-मोड प्लेट रीडर का उपयोग करके स्वचालन के लिए एक व्यापक रूपरेखा प्रदान की है।
Abstract
Macropinocytosis एक गैर-विशिष्ट द्रव-चरण अपटेक मार्ग है जो कोशिकाओं को बड़े बाह्य कोशिकीय कार्गो, जैसे प्रोटीन, रोगजनकों और सेल मलबे को थोक एंडोसाइटोसिस के माध्यम से आंतरिक बनाने की अनुमति देता है। यह मार्ग विभिन्न प्रकार की सेलुलर प्रक्रियाओं में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, जिसमें प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और कैंसर सेल चयापचय का विनियमन शामिल है। जैविक कार्य में इस महत्व को देखते हुए, सेल संस्कृति की स्थिति की जांच इस मार्ग के नियामकों की पहचान करके और उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण की खोज में नियोजित होने के लिए स्थितियों को अनुकूलित करके मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकती है। अध्ययन मानक प्रयोगशाला उपकरण ों का उपयोग करके एक स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण तकनीक का वर्णन करता है और अनुयायी कोशिकाओं में मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स के तेजी से परिमाणीकरण के लिए एक सेल इमेजिंग मल्टी-मोड प्लेट रीडर है। स्वचालित विधि उच्च आणविक भार फ्लोरोसेंट dextran के उत्थान पर आधारित है और एक प्रयोग में कई स्थितियों के आकलन की सुविधा के लिए 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट पर लागू किया जा सकता है या ग्लास coverslips पर घुड़सवार निश्चित नमूने। इस दृष्टिकोण का उद्देश्य पुनरुत्पादन को अधिकतम करना और प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करना है, जबकि समय की बचत और लागत प्रभावी दोनों है।
Introduction
मैक्रोपिनोसाइटोसिस का गैर-विशिष्ट एंडोसाइटिक मार्ग कोशिकाओं को पोषक तत्वों, प्रोटीन, एंटीजन और रोगजनकों सहित विभिन्न प्रकार के बाह्य कोशिकीय घटकों को आंतरिक बनाने की अनुमति देता है, जो बाहरी तरल पदार्थ और इसके घटकों के थोक उत्थान के माध्यम से होता है। हालांकि कई सेल प्रकारों के जीव विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है, तेजी से, मैक्रोपिनोसाइटोसिस मार्ग को ट्यूमर जीव विज्ञान में एक आवश्यक भूमिका निभाने के लिए वर्णित किया गया है, जहां, मैक्रोपिनोसाइटिक अपटेक के माध्यम से, ट्यूमर कोशिकाएं जीवित रहने में सक्षम होती हैं और पोषक तत्व-क्षीण माइक्रोएन्वायरमेंट 2,3 की उपस्थिति में फैलती हैं। एल्ब्यूमिन और एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स, और नेक्रोटिक सेल मलबे सहित एक्स्ट्रासेल्युलर मैक्रोमोलेक्यूल्स का उत्थान, मैक्रोपिनोसोम और लाइसोसोम संलयन-मध्यस्थता कार्गो कैटाबोलिज्म 4,5,6,7,8 के माध्यम से अमीनो एसिड, शर्करा, लिपिड और न्यूक्लियोटाइड बनाकर बायोमास उत्पादन के लिए एक वैकल्पिक पोषक तत्व स्रोत प्रदान करता है।
मैक्रोपिनोसाइटोसिस का प्रेरण और विनियमन जटिल है और सेलुलर संदर्भ के आधार पर भिन्न हो सकता है। इस प्रकार अब तक, मैक्रोपिनोसाइटोसिस के कई प्रेरकों की पहचान की गई है और इसमें लिगैंड शामिल हैं, जैसे कि एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक (पीडीजीएफ), गैलेक्टिन -3, और डब्ल्यूएनटी 3 ए 9, 10,11,12,13। इसके अलावा, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करने वाली संस्कृति की स्थिति मार्ग के सक्रियण को ट्रिगर कर सकती है। अग्नाशय डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) ट्यूमर पोषक तत्वों से वंचित हैं, विशेष रूप से अमीनो एसिड ग्लूटामाइन के लिए, जो कैंसर कोशिकाओं और कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) दोनों को जीवित रहने के लिए मैक्रोपिनोसाइटोसिस पर भरोसा करने का कारण बनता है7,13,14,15। इसके अलावा, ट्यूमर तनाव, जैसे कि हाइपोक्सिया और ऑक्सीडेटिव तनाव, इस स्कैवेंजिंग मार्ग 16 को सक्रिय कर सकते हैं। कई बाहरी प्रभावकों के अलावा जो मैक्रोपिनोसाइटोसिस को प्रेरित कर सकते हैं, विभिन्न प्रकार के इंट्रासेल्युलर मार्ग मैक्रोपिनोसोम गठन को नियंत्रित करते हैं। ऑन्कोजेनिक रास-मध्यस्थता परिवर्तन मैक्रोपिनोसाइटिक मशीनरी शुरू करने के लिए पर्याप्त है, और कई कैंसर प्रकार ऑन्कोजेनिक रास-संचालित संरचनात्मक मैक्रोपिनोसाइटोसिस 4,5,9,17 प्रदर्शित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, कैंसर कोशिकाओं और CAFs10,11,15,18 में मैक्रोपिनोसाइटोसिस को सक्रिय करने के लिए जंगली-प्रकार के रास सक्रियण और रास-स्वतंत्र मार्गों की पहचान की गई है। अवरोधक उपचार के साथ संयोजन में विभिन्न इन विट्रो मॉडल के उपयोग के परिणामस्वरूप कई मैक्रोपिनोसाइटोसिस मॉड्यूलेटर की पहचान हुई है, जिसमें सोडियम-हाइड्रोजन एक्सचेंजर्स, छोटे जीटीपीएस आरएसी 1, फॉस्फोइनोसिटाइड 3-किनेज (पीआई 3 के), पी 21-सक्रिय किनेज (पाक), और एएमपी-सक्रिय प्रोटीन किनेज (एएमपीके) 4,13,15 शामिल हैं। . हालांकि, मैक्रोपिनोसाइटोसिस को विनियमित करने वाले वर्णित कारकों और स्थितियों की भीड़ को देखते हुए, यह कल्पनीय है कि कई और मॉड्यूलेटर और उत्तेजनाएं अज्ञात रहती हैं। उपन्यास मॉड्यूलेटर और उत्तेजनाओं की पहचान को एक ही प्रयोग में स्थितियों की भीड़ के स्वचालित मूल्यांकन द्वारा सुविधाजनक बनाया जा सकता है। यह पद्धति मैक्रोपिनोसोम गठन में शामिल कारकों पर प्रकाश डाल सकती है और उपन्यास छोटे अणुओं या जीवविज्ञान की खोज के लिए अनुमति दे सकती है जो इस मार्ग को लक्षित करते हैं।
यहां, हमने विट्रो में कैंसर कोशिकाओं में मैक्रोपिनोसाइटोसिस की सीमा को निर्धारित करने के लिए अपने पहले से स्थापित प्रोटोकॉल को 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप और स्वचालित इमेजिंग और परिमाणीकरण 19,20 के लिए अनुकूलित किया है। यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी पर आधारित है, जो विट्रो में मैक्रोपिनोसाइटोसिस और विवो 4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18 में मैक्रोपिनोसाइटोसिस निर्धारित करने के लिए क्षेत्र में एक मानक बन गया है, 19,20,21,22. मैक्रोपिनोसोम को बड़े मैक्रोमोलेक्यूल्स को आंतरिक बनाने की उनकी क्षमता के माध्यम से अन्य एंडोसाइटिक मार्गों से अलग किया जा सकता है, जैसे कि उच्च आणविक वजन डेक्सट्रान (यानी, 70 केडीए)2,3,4,20,21,22,23। इस प्रकार, मैक्रोपिनोसोम को बाह्यकोशिकीय रूप से प्रशासित फ्लोरोफोर-लेबल वाले 70 केडीए डेक्सट्रान के उत्थान के माध्यम से परिभाषित किया जा सकता है। नतीजतन, मैक्रोपिनोसाइटिक पुटिकाएं 0.2-5 μm से लेकर आकार के साथ फ्लोरोसेंट पंक्टा के इंट्रासेल्युलर समूहों के रूप में प्रकट होती हैं। इन puncta माइक्रोस्कोपिक रूप से चित्रित किया जा सकता है और बाद में सेल में macropinocytosis की सीमा निर्धारित करने के लिए परिमाणित – ‘macropinocytic सूचकांक’.
इस प्रोटोकॉल में, 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट पर विट्रो में अनुयायी कोशिकाओं में मैक्रोपिनोसोम की कल्पना करने के लिए आवश्यक चरणों और मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके कवरलिप्स का वर्णन किया गया है (चित्रा 1)।। इसके अलावा, एक सेल इमेजिंग मल्टी-मोड प्लेट रीडर का उपयोग करके मैक्रोपिनोसाइटिक इंडेक्स की छवि अधिग्रहण और परिमाणीकरण को स्वचालित करने के लिए निर्देश प्रदान किए जाते हैं। यह स्वचालन हमारे पहले वर्णित प्रोटोकॉल 19,20 की तुलना में समय, लागत और प्रयास को कम करता है। इसके अलावा, यह अनजाने में पक्षपाती इमेजिंग अधिग्रहण और विश्लेषण से बचता है और इस प्रकार पुनरुत्पादन और विश्वसनीयता को बढ़ाता है। इस विधि को आसानी से विभिन्न सेल प्रकारों या प्लेट पाठकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या वैकल्पिक मैक्रोपिनोसोम सुविधाओं, जैसे आकार, संख्या और स्थान को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। यहां वर्णित विधि विशेष रूप से सेल संस्कृति स्थितियों की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है जो मैक्रोपिनोसाइटोसिस, उपन्यास मॉड्यूलेटर की पहचान, या ज्ञात अवरोधकों की दवा सांद्रता के अनुकूलन को प्रेरित करती है।
चित्रा 1: स्वचालित परख की योजनाबद्ध करने के लिए अनुयायी कोशिकाओं में ‘macropinocytic सूचकांक’ निर्धारित करने के लिए. BioRender का उपयोग कर बनाया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रयोगों और डेटा अधिग्रहण की गुणवत्ता अत्यधिक अभिकर्मकों की गुणवत्ता, सेटिंग्स के अनुकूलन, और कवरलिप्स और माइक्रोप्लेट की स्वच्छता पर निर्भर करती है। अंतिम परिणामों को प्रतिकृतियों के बीच न्यूनतम ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को NIH / NCI अनुदान (R01CA207189, R21CA243701) द्वारा C.C को समर्थित किया गया था। KMO.G. एक TRDRP पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप अवार्ड (T30FT0952) का प्राप्तकर्ता है। BioTek Cytation 5 सैनफोर्ड बर्नहैम प्रीस सेल इमेजिंग कोर का एक हिस्सा है, जो NCI कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट (P30 CA030199) से वित्तीय सहायता प्राप्त करता है। आंकड़े 1-3 BioRender का उपयोग कर बनाया गया था.
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25053CI | 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 mL Centrifuge tube | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2 L Beaker | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24-well Tissue culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 mL Reagent reservoir | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 mL Beaker | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| 6-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8-Channel aspiration adapter | Integra Biosciences | 155503 | |
| 8-Channel aspiration adapter for standard tips | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| Ammonia-free glass cleaner | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black 96-well high-content screening microplate | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| Cotton-tipped applicator | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | 12 mm diameter |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa – FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine-fixable |
| Dextran 70 kDa – TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | Without Calcium and Magnesium |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Formaldehyde, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagent Grade |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
| Hardening fluorescence mounting media | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certified ACS Plus, 36.5%–38.0% |
| Lint-free wipes | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope slides | Fisherbrand | 12-544-1 | Premium plain glass |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10013 | 8 channels, 0.5–10 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10012 | 12 channels, 20–200 µL |
| Multichannel pipette | Gilson | FA10011 | 8 channels, 20–200 µL |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| Plastic wrap | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Silicone isolators | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm |
| Slide adapter | Biotek | 1220548 | |
| Wash bottle | Fisherbrand | FB0340922C |
Referências
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