O presente protocolo descreve um método para coletar saliva suficiente de insetos que sugam piercings usando um meio artificial. Este é um método conveniente para coletar saliva de insetos e estudar a função salivar no comportamento de alimentação de insetos e transmissão de vírus transmitidos por vetores.
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Artigo de método
Método sanduíche de membrana de duas camadas para laodelphax striatellus saliva collection
Neste artigo
Resumo
Resumo
O vírus da tarja de arroz (RSV), que causa perda econômica significativa da agricultura no leste da Ásia, depende inteiramente de vetores de insetos para sua transmissão efetiva entre o arroz hospedeiro. Laodelphax striatellus (pequeno planthopper marrom, SBPH) é o vetor de insetos primário que transmite horizontalmente RSV enquanto suga seiva do phloem. A saliva desempenha um papel significativo no comportamento alimentar dos insetos. Um método conveniente que será útil para pesquisas sobre a saliva de insetos com comportamento de alimentação sugador de piercings é descrito aqui. Neste método, os insetos foram autorizados a se alimentar de uma dieta artificial sanduíche entre duas camadas de filme de parafina esticadas. A dieta contendo a saliva era coletada todos os dias, filtrada e concentrada para análise posterior. Por fim, a qualidade da saliva coletada foi examinada por manchas de proteína e imunoblotting. Este método foi exemplificado pela detecção da presença de RSV e de uma proteína semelhante à mucina na saliva de SBPH. Estes métodos artificiais de alimentação e coleta de saliva estabelecerão uma base para novas pesquisas sobre fatores na saliva de insetos relacionados ao comportamento alimentar e transmissão do vírus.
Introdução
O vírus da tarja de arroz (RSV), um vírus de RNA de ram-tease com fios negativos no gênero Tenuivirus,causa doenças graves na produção de arroz na Ásia Oriental1,2,3. A transmissão de RSV de plantas de arroz infectadas para as saudáveis depende de vetores de insetos, principalmente Laodelphax striatellus, que transmite RSV de forma persistente-propagativa. A SBPH adquire o vírus após se alimentar de plantas infectadas pelo RSV. Uma vez dentro do inseto, o RSV infecta a célula epitelial midgut um dia após a alimentação e, em seguida, passa através da barreira....
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Protocolo
1. Manutenção da SBPH
- Crie os viruliferosos e isentas de RSV SBPH em uma incubadora de vidro (65 x 200 mm) com 5-6 mudas de arroz(Oryza sativa cv. Nipponbare) por câmara de vidro no laboratório. Cultivar as plantas de arroz a 25 °C sob uma luz de 16 h / 8 h fotoperíodo escuro.
NOTA: Os viruliferosos e os indivíduos SBPH livres de RSV foram inicialmente capturados na província de Jiangsu, china. - Detecte o RSV no SBPH por um ensaio imunosorbente ligado a enzimas (ponto-ELISA) com um anticorpo policlonal específico rsv de coelho (ver Tabela de Materiais) levantado contra as ribonucleoproteínas RSV (RNPs).
NOTA: Para gar....
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Resultados
Esquemas de instalação de alimentação artificial e coleta de saliva
A Figura 1A retrata o cilindro de vidro (15 cm x 2,5 cm) usado como câmara de alimentação para coletar a saliva. Em primeiro lugar, as larvas SBPH ficaram famintas por várias horas para melhorar a eficiência da coleta e depois imobilizadas por resfriamento por 5 minutos. Depois que os insetos foram transferidos para o cilindro de vidro, ambas as extremidades abertas da câmara foram cobertas com membrana p.......
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Discussão
A criação bem sucedida de insetos em dietas artificiais foi relatada pela primeira vez em 1962, quando Mittler e Dadd descreveram a técnica de membrana parafina para manter uma dieta artificial29,30. E esse método tem sido explorado em muitos aspectos da biologia e comportamento de insetos, por exemplo, suplemento de nutrientes, alimentação de dsRNA e aquisição de vírus. Com base nos requisitos da análise da saliva, 5% da sacarose é utilizada como dieta artificia.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (nº 2019YFC1200503), pela Fundação Nacional de Ciência da China (No. 32072385) e pela Associação de Promoção da Inovação Juvenil CAS (2021084).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Filtro centrífugo 10-KD | Merck Millipore | R5PA83496 | Para concentração |
| 10x Tampão de Transferência de Proteína(úmido) | macGENE | MP008 | Tampão de transferência para western blotting |
| 10x Tampão TBST | Coolaber | SL1328-500mL&vezes; 10 | Tampão de lavagem para western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Sistema de imagem para western blotting e coloração de prata |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Marcador de proteína para western blotting |
| ECL reagentes de detecção de western blotting | GE Healthcare | RPN2209 | Detecção de western blotting |
| Kit cromogênico HRP-DAB aprimorado | TIANGEN | Reação cromogênica | |
| Anticorpos anti-coelho de cabra conjugados com peroxidase de rábano | Sigma | 401393-2ML | Anticorpo secundário policlonal para western blotting |
| Immobilon(R)-P Membrana de difluoreto de polivinilideno | Merck Membrana | de transferência de IPVH00010 | Millipore para western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | Para PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | Para PCR Transcricional Reversa (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µ m | Merck Millipore | SLGP033RB | Para filtração |
| Mini-PROTEAB TGX Géis | Bio-Rad | 4561043 | Para SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detecção de concentração de proteína |
| Membrana de nylon | PALL | T42754 | Membrana para dot-ELISA |
| Parafilm M Membrana | Sigma | P7793-1EA | Fazendo dieta artificial sanduíches |
| Anticorpo policlonal anti-LssgMP de coelho contra peptídeos LssgMP | Genstript | Anticorpo policlonal primário anti-LssgMP de coelho para western blotting | |
| Anticorpo policlonal anti-RSV de coelho | Genstript | Anticorpo policlonal primário anti-RSV para western blotting e dot-ELISA | |
| RNAprep puro Micro Kit | TIANGEN | DP420 | para extração de RNA |
Referências
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Vir....
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Reimpressões e permissões
