इस प्रोटोकॉल को संस्कृति tetrahydrobiopterin (BH4) के लिए स्थापित किया गया है – और inducible नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (iNOS) – NO-redox जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक मुरीन मैक्रोफेज की कमी। अध्ययन बीएच 4 और पारंपरिक अलगाव और संस्कृति विधियों में पाए जाने वाले अन्य कलाकृतियों के संभावित संदूषण को कम करने पर केंद्रित है जो प्रयोगात्मक परिणामों और परिणामों की व्याख्या को भ्रमित कर सकते हैं।
मैक्रोफेज पूरे शरीर में हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाओं से व्युत्पन्न होते हैं, भड़काऊ प्रक्रियाओं के लिए केंद्रीय होते हैं, और जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में भाग लेते हैं। मैक्रोफेज के इन विट्रो अध्ययन को पेरिटोनियम से पूर्व विवो संस्कृति द्वारा या अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) बनाने के लिए माइलॉयड अस्थि मज्जा पूर्वज कोशिकाओं के भेदभाव के माध्यम से किया जा सकता है। अग्रदूतों से मैक्रोफेज भेदभाव के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण में L929 कोशिकाओं (LCM) से वातानुकूलित मीडिया का उपयोग शामिल है। यह मीडिया स्व-उत्पादन के लिए आसान है, लेकिन बैच परिवर्तनशीलता से ग्रस्त है, और इसके घटक अपरिभाषित हैं। इसी तरह, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का उपयोग विकास का समर्थन करने के लिए किया जाता है, लेकिन इसमें अपरिभाषित अणुओं का एक विशाल मिश्रण होता है जो बैचों के बीच भिन्न हो सकता है। ये विधियां नाइट्रिक ऑक्साइड जीव विज्ञान और रेडॉक्स तंत्र के अध्ययन के लिए पर्याप्त नहीं हैं क्योंकि वे दोनों में पर्याप्त मात्रा में छोटे अणु होते हैं जो या तो रेडॉक्स तंत्र या कोफ़ैक्टर्स के पूरक स्तर के साथ हस्तक्षेप करते हैं, जैसे कि टेट्राहाइड्रोबिओप्टेरिन (बीएच 4), इंड्यूसिबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (आईएनओएस) से एनओ के उत्पादन के लिए आवश्यक है। इस रिपोर्ट में, हम सेल विकास और भेदभाव के लिए उपयुक्त परिस्थितियों को बनाए रखते हुए बहिर्जात बायोप्टेरिन के स्तर को कम करके नो-रेडॉक्स पर्यावरण के नियंत्रण के लिए अनुमति देने वाला एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। संस्कृति मीडिया संरचना का तंग नियंत्रण प्रयोगात्मक पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने में मदद करता है और परिणामों की सटीक व्याख्या की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में, BMDM को एक GTP cyclohydrolase (GCH) से प्राप्त किया गया था – माउस मॉडल की कमी। BMDM की संस्कृति या तो (i) वातानुकूलित LCM, या (ii) पुनः संयोजक M-CSF और GM-CSF युक्त मीडिया के साथ किया गया था, जबकि BH4 और NO-कमी वाली संस्कृति की स्थिति प्राप्त करते हुए न्यूनतम कलाकृतियों का उत्पादन करने के लिए – इस प्रकार NO-redox जीव विज्ञान और विट्रो में immunometabolism के पुनरुत्पादक अध्ययन के लिए अनुमति देता है।
मैक्रोफेज को विभिन्न प्रकार की बीमारियों और स्थितियों में एक दिलचस्प सेल प्रकार के रूप में स्थापित किया गया है, कई प्रतीत होता है कि जन्मजात प्रतिरक्षा पर उनके पारंपरिक ध्यान से असंबंधित हैं। चूंकि मैक्रोफेज फिजियोलॉजी ऊतक या पर्यावरण पर बहुत अधिक निर्भर है, इसलिए उनके कार्य और इसमें शामिल विभिन्न मार्गों का अध्ययन करने के लिए कई तरीके और मॉडल उत्पन्न हुए हैं। ऐतिहासिक रूप से, मैक्रोफेज सेल लाइनों, जैसे RAW264.7, क्षेत्र पर हावी थे, लेकिन इन्हें धीरे-धीरे विभिन्न प्राथमिक सेल मॉडल के पक्ष में बदल दिया गया है। उदाहरण के लिए, थायोग्लाइकोलेट के साथ उपचार के बाद मुरीन मैक्रोफेज को पेरिटोनियल लैवेज से अलग किया जा सकता है। ऊतक-निवासी कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान करते समय, इन पेरिटोनियल मैक्रोफेज को विभिन्न बाहरी उत्तेजनाओं के लिए अधिक वश में प्रतिक्रिया प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है, जिससे कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उनकी उपयुक्ततासीमित हो जाती है।
एक विकल्प के रूप में, अस्थि मज्जा में माइलॉयड पूर्वज कोशिकाओं से व्युत्पन्न अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम), मैक्रोफेज जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल के रूप में उभरे हैं, जिसमें परिपक्वता और मैक्रोफेज से जुड़े विभिन्न शास्त्रीय फेनोटाइप, एम 0 (भोले, गैर-सक्रिय), एम 1 (प्रो-इंफ्लेमेटरी, आमतौर पर एलपीएस / आईएफएन के साथ सक्रिय) और एम 2 (प्रो-रिज़ॉल्यूशन, आमतौर पर आईएल -4)2 के साथ सक्रिय होता है, ३ । हालांकि, बीएमडीएम में माइलॉयड पूर्वज कोशिकाओं का भेदभाव संस्कृति मीडिया 4,5 में मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) की उपस्थिति पर निर्भर करता है। यह या तो मीडिया में जोड़े गए शुद्ध प्रोटीन के रूप में या L929 वातानुकूलित मीडिया (LCM) से आपूर्ति की जा सकती है। बीएमडीएम (लागत और दक्षता) का उपयोग करने के फायदों को विभिन्न उत्तेजनाओं (साइटोकिन्स, चयापचय मध्यवर्ती, और आरएनएस / आरओएस) के प्रति उनकी संवेदनशीलता द्वारा प्रस्तुत सीमाओं के खिलाफ तौला जाना चाहिए।
पिछले आंकड़ों से संकेत मिलता है कि एलसीएम की सामग्री खराब रूप से परिभाषित और आंतरिक रूप से परिवर्तनशील है, जिसके परिणामस्वरूप उनके विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अविश्वसनीय और अनुपयुक्त हैं, विशेष रूप से वे विशेष रूप से एनओ या रेडॉक्स जीव विज्ञान से संबंधित हैं, क्योंकि ये बहिर्जात यौगिकों की उपस्थिति से बहुत प्रभावित हो सकते हैं। इस प्रकार, यह विस्तृत प्रोटोकॉल अच्छी तरह से परिभाषित DMEM के उपयोग के लिए कहता है: बैच भिन्नता के लिए कम बैच के साथ F12 मीडिया और पुनः संयोजक मुरीन एम-सीएसएफ और जीएम-सीएसएफ (ग्रैनुलोसाइट्स-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक) के अलावा। इसके अलावा, भ्रूण गोजातीय सीरम आमतौर पर ऊतक संस्कृति मीडिया में एक पूरक के रूप में उपयोग किया जाता है, खराब परिभाषित यौगिकों और अंतर्निहित परिवर्तनशीलता का एक और स्रोत प्रदान करता है। इसलिए, बीएमडीएम की विश्वसनीय संस्कृति सुनिश्चित करने के लिए इस तरह के एडिटिव्स के उपयोग को नियंत्रित करना और अनुकूलित करना आवश्यक है। एफबीएस के एक परिभाषित कम एंडोटॉक्सिन स्रोत का उपयोग करके और यह सुनिश्चित करके कि एकल बैचों को थोक खरीदा जाता है, संस्कृति की स्थिति को मज़बूती से परिभाषित किया जाता है, और पुनरुत्पादन सुनिश्चित किया जाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को 95% शुद्धता से ऊपर एक मैक्रोफेज संस्कृति का उत्पादन करने के लिए प्रदर्शित किया गया है जब प्रवाह साइटोमेट्री 6 द्वारा मैक्रोफेज सतह मार्करों CD45 और CD11b के लिए मूल्यांकन किया जाताहै।
इस BH4- और NO-कमी वाले BMDM संस्कृति प्रोटोकॉल को टेट्राहाइड्रोबिओप्टेरिन (BH4) और अन्य हस्तक्षेप कलाकृतियों की कमी के माध्यम से प्राथमिक मैक्रोफेज में NO-redox जीव विज्ञान की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिसका उद्देश्य इन प्रयोगात्मक मॉडलों से प्राप्त परिणामों की विश्वसनीयता और पुनरुत्पादन को बढ़ाना है।
महत्वपूर्ण चरणों में सही प्लास्टिक के बर्तन का उपयोग शामिल है। मैक्रोफेज पूर्वज अनुयायी कोशिकाएं हैं और बहुत चिपचिपा हैं; इसलिए गैर-ऊतक संस्कृति (टीसी) उपचारित प्लेटों का उपयोग उन्हें अन्य पूर्वज कोशिकाओं से चुनने और अलग करने में महत्वपूर्ण है, जो अन्यथा शुद्धता को संलग्न और कम कर सकते हैं। फसल के दिन, प्लेटों से मैक्रोफेज को अलग करने के लिए बर्फ-ठंडे पीबीएस की आवश्यकता होती है, लेकिन ईडीटीए का उपयोग करना या यहां तक कि स्क्रैपिंग कोशिकाओं को बहुत धीरे-धीरे डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के आधार पर किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, लिसेड बनाम लाइव सेल प्रयोग)। संदूषण के संबंध में भी विशेष ध्यान रखा जाना चाहिए। अस्थि मज्जा को बाहर निकालते समय, बचे हुए फर और त्वचा से बैक्टीरिया या वायरल कणों के साथ संभावित क्रॉस-संदूषण हो सकता है। तब जितना संभव हो उतना सावधान और बाँझ होना आवश्यक है; इसलिए कुछ मिनटों के लिए 70% इथेनॉल में विच्छेदित पैरों को डुबोने को प्रोत्साहित किया जाता है। इसी तरह, मैक्रोफेज बढ़ने के दौरान एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करना अत्यधिक अनुशंसित है।
इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा दिन 0 पर सेल-चढ़ाना घनत्व से उत्पन्न होती है। फ्लश अस्थि मज्जा में विभिन्न प्रकार की कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें गलत तरीके से गिना जा सकता है और मैक्रोफेज पूर्वजों के रूप में शामिल किया जा सकता है, इस प्रकार एक झूठी कुल सेल संख्या के लिए अग्रणी है। बाद और संभावित परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, अलग-थलग मैक्रोफेज को दिन 7 पर गर्म पीबीएस का उपयोग करके धीरे-धीरे फ्लश किया जा सकता है और 2% एफबीएस डीएमईएम में सही घनत्व पर फिर से मढ़वाया जा सकता है: पालन की अनुमति देने के लिए उत्तेजना से पहले एफ 12 कम से कम 1 घंटे पहले।
अंत में, Griess परख द्वारा नाइट्राइट के स्तर की जाँच बड़े मैक्रोफेज से मीडिया का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करने के लिए अनिवार्य है. प्लस पक्ष पर, इस परख त्वरित और सस्ती प्रदर्शन करने के लिए है.
जैसा कि यहां प्रदर्शित किया गया है, यह अनुकूलित प्रोटोकॉल एल-सेल वातानुकूलित मीडिया (एलसीएम) का उपयोग करके मैक्रोफेज को अलग करने और खेती करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिक सामान्य प्रोटोकॉल के लिए एक अधिक परिभाषित और बेहतर विकल्प है। दरअसल, नो-रेडॉक्स जीव विज्ञान का अध्ययन करते समय एलसीएम का उपयोग करने वाली मुख्य चिंताओं में से एक बायोप्टेरिन की महत्वपूर्ण मात्रा का पता लगाया जाता है, जिससे संभावित चयापचय परिवर्तन10 हो जाते हैं। उदाहरण के लिए, बहिर्जात बीएच 4 जल्दी से कमी वाले मॉडल को फिर से भर सकता है और आईएनओएस के लिए एक कोफ़ैक्टर के रूप में कार्य कर सकता है, जिससे नाइट्रिक ऑक्साइड का अवांछित उत्पादन होता है। एलसीएम का उपयोग करने का एक और नुकसान इसके उत्पादन में निहित है – एलसीएम कॉलोनी-उत्तेजक कारकों, साइटोकिन्स और एल -929 कोशिकाओं द्वारा सीधे स्रावित अन्य उप-उत्पादों का मिश्रण है, जो सभी मैक्रोफेज फिजियोलॉजी6 को प्रभावित कर सकते हैं। एम-सीएसएफ में इसकी महान आपूर्ति के बावजूद, मैक्रोफेज प्रसार और अस्तित्व के लिए आवश्यक, बैच से बैच तक प्रत्येक घटक की भिन्नता प्रयोगों में परिवर्तनशीलता के जोखिम को बढ़ाती है।
दोनों मुद्दों को संबोधित करने के लिए, यह नया प्रोटोकॉल अच्छी तरह से परिभाषित DMEM का उपयोग करता है: F12 मीडिया जिसमें बायोप्टेरिन के निम्न स्तर होते हैं, जिसमें शुद्ध एम-सीएसएफ और जीएम-सीएसएफ की एक नियंत्रित मात्रा जोड़ी जाती है। दोनों साइटोकिन्स मैक्रोफेज के भेदभाव और विकास में सहायता करते हैं। एम-सीएसएफ विशेष रूप से मैक्रोफेज11 में हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव का आश्वासन देकर अस्थि मज्जा पूर्वज कोशिकाओं से बीएमडीएम की पीढ़ी की ओर जाता है। इसके अलावा, जीएम-सीएसएफ को भड़काऊ साइटोकाइन और नो उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है जब उत्तेजना से पहले जोड़ा जाता है, तो नो-रेडॉक्स जीव विज्ञान12,13 का अध्ययन करते समय एक वास्तविक लाभ।
अन्य मुख्य कारक इस नई विधि को संबोधित करता है कि एफबीएस, आमतौर पर अच्छे स्वास्थ्य और कोशिकाओं के विकास के लिए आवश्यक पोषक तत्वों के स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है। एलसीएम के समान, एफबीएस में बायोप्टेरिन के महत्वपूर्ण स्तर होते हैं। जबकि उत्तेजना से पहले कोशिकाओं की पूरी सीरम भुखमरी को शुरू में OptiMEM + 0.2% BSA का उपयोग करके माना जाता था, मैक्रोफेज ने टुकड़ी के संकेत दिखाए, जो बेली एट अल.6 द्वारा वर्णित सेल व्यवहार्यता में कमी का संकेत था। हालांकि, जैसा कि मैक्रोफेज ने सीरम के लिए एक पूर्ण आवश्यकता का प्रदर्शन किया, बायोवेस्ट से अल्ट्रा-लो एंडोटॉक्सिन एफबीएस का चयन किया गया था। बैचों को बायोप्टेरिन के लिए परीक्षण किया गया था और एक विश्वसनीय और अच्छी तरह से परिभाषित आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए थोक खरीद से पहले पूर्व-चयनित किया गया था। बायोप्टेरिन के प्रदूषणकारी स्रोतों को कम करने के उद्देश्य से आगे बढ़ने के लिए, एफबीएस की कम सांद्रता का परीक्षण किया गया था। सेल संस्कृति में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले 10% सीरम का उपयोग करने के बजाय, एफबीएस स्तर को मैक्रोफेज में अस्थि मज्जा के 7-दिवसीय भेदभाव के दौरान 5% तक रखा जाता है और अंतिम दिन रातभर उत्तेजना के दौरान 2% तक कम कर दिया जाता है। यह बायोप्टेरिन के नगण्य स्तर का पता लगाया गया है लेकिन अच्छे स्वास्थ्य और मैक्रोफेज के पालन के लिए पर्याप्त पोषक तत्व सुनिश्चित करता है। यद्यपि पुनः संयोजक एम-सीएसएफ का उपयोग करके इस नए अनुकूलित प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप प्राथमिक मैक्रोफेज की संस्कृति और सक्रियण के लिए अधिक नियंत्रित वातावरण होता है, मुख्य सीमा यह है कि यह विधि एलसीएम विधि का उपयोग करने की तुलना में अधिक महंगी है।
इन सभी कारकों को ध्यान में रखते हुए, दोनों तरीकों की तब सीधे तुलना की गई थी। महत्वपूर्ण रूप से, पुनः संयोजक एम-सीएसएफ और जीएम-सीएसएफ का उपयोग करके यहां प्रस्तुत किए गए नए संशोधित प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप एक अधिक पुनरुत्पादक प्रणाली हुई जहां मीडिया बीएच 4 को दूषित करने से रहित था। इसके प्रभाव दो गुना थे; बीएच 4-कमी वाली कोशिकाओं में वास्तव में बीएच 4 की कमी थी, जिसके परिणामस्वरूप एलपीएस के साथ एम 1 स्थिति के लिए उत्तेजना के बाद मीडिया में न्यूनतम पता लगाने योग्य नाइट्राइट संचय हुआ। यह एलसीएम में सुसंस्कृत उन्हीं बीएमडीएम कोशिकाओं के विपरीत था, जहां महत्वपूर्ण बीएच 4 और नाइट्राइट का पता लगाया गया था।
निष्कर्ष निकालने के लिए, इस विधि की ताकत प्रत्येक पैरामीटर का पूरी तरह से आकलन करके बायोप्टेरिन के स्तर को नियंत्रित करने के प्रयास में निहित है जो मैक्रोफेज में नो और रेडॉक्स सिग्नलिंग को प्रभावित कर सकती है। विशेष रूप से, यह NO-redox जीव विज्ञान क्षेत्र में अधिकतम reproducibility और मानकीकरण सुनिश्चित करता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एम.जे. .C(FS/14/56/31049), ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन प्रोग्राम अनुदान (RG/17/10/32859 और RG/12/5/29576), वेलकम ट्रस्ट (090532/Z/09/Z), और NIH Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Centre को सम्मानित किया गया था। लेखक बीएचएफ सेंटर ऑफ रिसर्च एक्सीलेंस, ऑक्सफोर्ड (आरई / 13 / 1 / 30181 और आरई / 18 / 3 / 34214) से समर्थन को भी स्वीकार करना चाहते हैं।
1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
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