Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay mittels konfokaler Mikroskop-Bildgebungsanalyse
Summary
Extrazelluläre Vesikel (EVs) tragen zur Zellbiologie und interzellulären Kommunikation bei. Es besteht ein Bedarf an praktischen Assays, um die Aufnahme von Elektrofahrzeugen durch die Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Das aktuelle Protokoll schlägt den EV-Aufnahmeassay vor, indem eine dreidimensionale Fluoreszenzbildgebung mittels konfokaler Mikroskopie verwendet wird, nachdem die EV-Isolierung durch ein mikrofluidisches Gerät auf Nanofiltrationsbasis erfolgt.
Abstract
Es besteht ein Bedarf an praktischen Assays, um die extrazelluläre Vesikelaufnahme (EV) der Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Die Aufnahme von Elektrofahrzeugen spielt eine Rolle bei der interzellulären Kommunikation in verschiedenen Forschungsbereichen; Krebsbiologie, Neurowissenschaften und Arzneimittelabgabe. Viele EV-Aufnahmeassays wurden in der Literatur berichtet; Es fehlt jedoch an einer praktischen, detaillierten experimentellen Methodik. Die EV-Aufnahme kann durch fluoreszierende Markierung von EVs beurteilt werden, um ihre Position in Zellen zu erkennen. Die Unterscheidung zwischen internalisierten EVs in Zellen und den oberflächlichen EVs auf Zellen ist schwierig, aber kritisch, um die EV-Aufnahme genau zu bestimmen. Daher wird in dieser Arbeit ein Assay vorgeschlagen, der die EV-Aufnahme durch dreidimensionale (3D) Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie effizient quantifiziert. Fluoreszenzmarkierte EVs wurden mit einem auf Nanofiltration basierenden mikrofluidischen Gerät hergestellt, durch konfokale 3D-Mikroskopie visualisiert und dann durch fortschrittliche Bildverarbeitungssoftware analysiert. Das Protokoll bietet eine robuste Methodik für die Analyse von Elektrofahrzeugen auf zellulärer Ebene und einen praktischen Ansatz für eine effiziente Analyse.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanogroße, lipidmembrangebundene Partikel, die nach ihren Größen kategorisiert werden: Ektosomen (100-500 nm) und Exosomen (50-150 nm)1. EVs enthalten verschiedene Biomoleküle wie Proteine, Nukleinsäuren und Lipide. Diese Biomoleküle stammen aus den Zellen, bevor sie als Fracht eingekapselt und über EVs in den extrazellulären Raum freigesetzt werden1,2,3.
Aufgrund der Vielfalt ihrer Ladung wird angenommen, dass Elektrofahrzeuge eine aktive Rolle in der interzellulären Kommunikation spielen. Die Freisetzung und Aufnahme von EVs durch Zellen ermöglicht den Transfer von Biomolekülen zwischen den Zellen4,5. Die Einführung von EV-Ladung in eine Zelle kann die Funktionen und den homöostatischen Zustand der Empfängerzelle verändern4,5,6. EVs werden über mehrere Wege verinnerlicht; Die genauen Mechanismen wurden jedoch nicht genau demonstriert.
Die Mehrheit der EV-Aufnahmeassays, wie z. B. genetische Markierungen, markiert fluoreszierend einzelne EVs7. Das resultierende Signal kann per Mikroplattenphotometer, Durchflusszytometrie oder Mikroskopie gemessen werden, wobei jede Technologie erhebliche Einschränkungen aufweist. Mikroplattenphotometer, Durchflusszytometrie oder zweidimensionale Standardmikroskopie (2D) können nicht zwischen internalisierten und oberflächlich angebrachten EVs unterscheiden8,9. Darüber hinaus kann die notwendige Probenvorbereitung für jede dieser Techniken zusätzliche Probleme bei der Bewertung der EV-Aufnahme mit sich bringen. Zum Beispiel kann das Anheben von anhaftenden Zellen mit Trypsin vor der EV-Aufnahmeanalyse einige oberflächlich angebrachte EVs auf der Zelloberfläche spalten10,11. Trypsin kann auch mit der Zelloberfläche interagieren und den Zell- und EV-Phänotyp beeinflussen. Darüber hinaus kann Trypsin oberflächliche EVs nicht vollständig lösen, wodurch isolierte Populationen verzerrt werden.
Um EVs genau mit Fluoreszenzfarbstoffen zu kennzeichnen, sind zusätzliche Waschschritte erforderlich, um den Restfarbstoff zu entfernen7. Akzeptierte Isolationstechniken können auch zu falsch-positiven Signalen aufgrund der Koagulation beitragen, die während der EV-Isolierung auftritt. Zum Beispiel wird die serielle Ultrazentrifugation (UC) häufig verwendet, um EVs zu isolieren und den immobilisierten Farbstoff zu entfernen. UC kann jedoch EVs mitverfälschen, und der Restfarbstoff kann zu einem falsch-positiven Signal führen12,13. Andere Nanofiltrationsmethoden, wie die säulenbasierte Filtration, werden ebenfalls häufig für die nicht immobilisierte Farbstoffentfernung verwendet. Die komplexe Natur von EVs und Farbstoffen, die innerhalb der Säulenmatrix interagieren, kann zu einer unvollständigen Entfernung des Restfarbstoffs führen, da der molekulare Cut-off der Säule durch den komplexen Input verändert wird14,15,16.
Das aktuelle Protokoll schlägt ein nanofiltrationsbasiertes mikrofluidisches Gerät vor, um fluoreszenzmarkierte isolierte EVs zu isolieren und zu waschen. Das auf Nanofiltration basierende mikrofluidische Gerät kann eine effiziente Filtration über die flüssigkeitsunterstützte Trenntechnologie (FAST)17,18 ermöglichen. FAST reduziert den Druckabfall über den Filter und reduziert so die potenzielle Aggregation zwischen Elektrofahrzeugen und Farbstoffen. Durch die effiziente Entfernung von Restfarbstoffen ist es möglich, die Qualität fluoreszenzmarkierter EVs und die Spezifität des Assays zu verbessern.
Die konfokale Mikroskopie kann zwischen internalisierten und oberflächlich angebrachten EVs auf der Zelloberfläche unterscheiden und die zellulären Mechanismen der EV-Aufnahme in einer raumzeitlichen Auflösung umfassend untersuchen19,20,21,22,23,24,25. Zum Beispiel beschrieben Sung et al. die Visualisierung des Exosomen-Lebenszyklus mit ihrem entwickelten Live-Cell-Reporter. Die Position der verinnerlichten EVs wurde mit einem konfokalen Mikroskop in dreidimensionalen (3D) und Post-Bildverarbeitungswerkzeugen erkannt und analysiert20. Obwohl die Größe kleiner EVs (40-200 nm) unter der Auflösungsgrenze des optischen Mikroskops liegt, können die fluoreszenzmarkierten EVs durch konfokale Mikroskopie nachgewiesen werden, da der Photodetektor die verstärkte Fluoreszenzemission nachweisen kann. Daher kann die subzelluläre Lokalisation der fluoreszenzmarkierten EVs innerhalb einer Zelle präzise bestimmt werden, indem mehrere z-gestapelte Bilder der EVs und der umgebenden Zellorganellen aufgenommen werden.
Darüber hinaus können die 3D-Rekonstruktion und die Nachdatenverarbeitung weitere Einblicke in die Positionierung der verinnerlichten, oberflächlichen und frei schwebenden Elektrofahrzeuge geben. Durch die Verwendung dieser Prozesse in Verbindung mit der Zeitraffer-Live-Cell-Bildgebung, die die konfokale Mikroskopie bietet, kann der Grad der EV-Aufnahme genau bewertet werden, und die Echtzeitverfolgung der EV-Aufnahme ist ebenfalls möglich. Darüber hinaus kann die EV-Trafficking-Analyse unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie durchgeführt werden, indem die Co-Lokalisation von EVs mit Organellen bewertet wird, ein erster Schritt, um zu bestimmen, wie internalisierte EVs an der intrazellulären Funktion beteiligt sind. Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur Durchführung eines EV-Aufnahmeassays unter Verwendung des nanofiltrationsbasierten mikrofluidischen Geräts17,26, der konfokalen Mikroskopie und der Post-Image-Analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein EV-Aufnahmeassay, der auf 3D-Fluoreszenzbildgebung mittels konfokaler Mikroskopie basiert, bietet eine effiziente Methodik und empfindliche Analyse. Diese fluoreszierende EV-Markierung erleichtert die Visualisierung von Elektrofahrzeugen und führt erfolgreich einen präzisen EV-Aufnahmeassay durch. Frühere Methoden zur Kennzeichnung von Elektrofahrzeugen und zur Entfernung des Restfarbstoffs wurden durch Entfernen der Fällung mittels Ultrazentrifugation (UC) berichtet; UC kann jedoch EVs mitausfällen, un…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch NGI-Fördernummern unterstützt. U54CA143803, CA163124, CA093900 und CA143055 an K. J. P. Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss des Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) unterstützt, das vom Ministerium für Gesundheit und Soziales der Republik Korea finanziert wurde (Fördernummer: HI19C1122). Arbeiten von J. Kim und Y.-K. Cho wurde vom Institute for Basic Science (IBS-R020-D1) unterstützt, das von der koreanischen Regierung finanziert wurde. Die Autoren danken den aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Brady Urological Institute, insbesondere den Mitgliedern des Pienta-Amend-Labors, für die kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
Referências
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -. K., Cho, Y. -. K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -. T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-‘T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -. K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -. H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
