Denne protokol beskriver en metode til isolering af neutrofiler fra fuldblod, buffy frakker, eller leukaferse membraner, opnå godt udbytte, høj renhed, og minimal celle aktivering. Vi bruger gradient rensning, rød blodlegemer (RBC) sedimentering, og RBC lysis at opnå en høj kvalitet / renhed neutrophil forberedelse.
Neutrofiler (PMNs) er de mest rigelige leukocytter i menneskelig omsætning, der spænder fra 40 til 70% af det samlede blod leukocytter. De er de første celler rekrutteret på stedet for betændelse via hurtig ekstravasation gennem fartøjer. Der udfører neutrofiler en række funktioner for at dræbe invaderende patogener og mægle immunsignalering. Friskrensede neutrofiler fra humant blod er den foretrukne model for undersøgelse, da ingen cellelinje fuldt replikerer PMN-funktioner og biologi. Neutrofiler er imidlertid kortvarige, terminalt differentierede celler og er meget modtagelige for aktivering som reaktion på fysiske (temperatur, centrifugeringshastighed) og biologiske (endotoksin-, kemo- og cytokiner) stimuli. Derfor er det afgørende at følge en standardiseret, pålidelig og hurtig metode til at opnå rene og ikke-aktiverede celler. Denne protokol præsenterer en opdateret protokol, der kombinerer tæthedsgradientcentrifugering, RBC-sedimentering (Red Blood) og RBC lysis for at opnå høj PMN-renhed og minimere celleaktivering. Desuden diskuteres metoder til vurdering af neutrophil isolation kvalitet, levedygtighed og renhed også.
Det medfødte immunsystem består af mange celletyper, der opretholder immun homøostase og patogen clearance sammen med mange andre fysiologiske funktioner. Neutrofiler omfatter den største pulje af hvide blodlegemer i menneskets omsætning1. De fleste modne neutrofiler opbevares i knoglemarven, som er stedet for generation til nye neutrofiler, også kaldet granulopoiesis. I knoglemarven forlader granulocytforfadererne cellecyklussen og differentierer terminalt og erhverver deres karakteristiske segmenterede kerner og granulat2. Under inflammatoriske tilstande mobiliseres neutrofiler fra blodbanen og ud af knoglemarven som reaktion på chemokiner, cytokiner og skadesrelaterede og patogenrelaterede molekylære mønstre fra blodbanen og ud af knoglemarven for at udføre en bred vifte af funktioner. Disse omfatter cytokin sekretion, direkte fagocytose af patogenetose, frigivelse af reaktive iltarter, degranulation af antimikrobielle proteiner, og dannelse af neutrophil ekstracellulære fælder.
De molekyler, der anvendes af neutrofiler til at bekæmpe infektion er giftige for mikrober og værten. Således er levetiden og korrekt fjernelse af aldrende / døende neutrofiler stærkt reguleret, og de har en begrænset levetid i omløb (<48 h)3. På grund af denne korte overlevelse producerer menneskekroppen i gennemsnit 100 milliarder nye neutrofiler hver dag for at opretholde befolkningen homøostase4. Emergency granulopoiesis kan yderligere øge frigivelsen af neutrofiler, både modne og umodne, i blodet under betændelse og infektion5. Betydningen af neutrofiler i det medfødte immunrespons fremhæves af patienter med erhvervet eller medfødt neutropeni, som er modtagelige for bakterie- og svampeinfektioner6.
Mange udfordringer opstår, når man studerer neutrophilbiologi og deres roller i immunresponset på grund af deres natur, herunder deres korte overlevelse og cytotoksiske indhold. Neutrohil-lignende cellelinjer er blevet almindeligt differentieret fra human promyelocytic leukæmi HL-60 celler og PLB-985 celler7,8. Selv om de kan vise neutrohil-lignende morfologi og udføre chemotaxis, kan disse cellelinjer ikke fuldt ud generobre biologi neutrofiler. In vitro assays ved hjælp af disse cellelinjer er heller ikke i stand til at generobre in vivo eksperimenter. Desuden skal differentiering af disse celler induceres og kan påvirkes negativt af genmanipulation før differentiering.
For nylig er der udviklet metoder til at omgå disse problemer ved at bruge indukible initiativtagere til at modulere genekspression efter differentiering i HL-60-celler9. Selv med sådanne værktøjer er primære menneskelige PMN’er forpligtet til at validere mål ved hjælp af farmakologiske tilgange. Det er derfor bydende nødvendigt at opnå rene og inaktiverede neutrofiler isoleret fra blod for at validere resultaterne af cellelinje- og dyremodeller. Dette dokument præsenterer en revideret PMN isolation protokol, hvor fordele og ulemper ved de nuværende metoder blev evalueret10. En kombination blev udtænkt bestående af gradient centrifugering for at adskille PMN’er fra andre immunceller, kort dextran-baseret sedimentering for at fjerne hovedparten af RBC’er, hurtige resterende RBC lysis via osmotisk tryk og lavhastighedscentrifugering for at fjerne blodpladeforurening.
På grund af neutrofilers korte levetid, terminaldifferentieringsstatus og lytic-indhold har det altid været en udfordring at studere disse celler. Bortset fra at bruge musemodeller eller celler fra patientkohorter er cellelinjer nyttige værktøjer til at hjælpe med at studere neutrohilbiologi16. Men neutrohil-lignende cellelinjer kan ikke helt gentage alle aspekter af neutrophil biologi, tilføjer et ekstra lag af vanskeligheder med at studere disse celler. Den mest almindeligt anvendte in vitro-model er HL-60 cellelinjen, som kan differentieres i neutrofilerlignende celler ved behandling med dimethylsulfoxid eller retinosyre17,18. Selv om disse celler er nyttige i studiet af migration og respiratorisk burst, er de ikke egnede til at studere neutrofilers mikrobiocidale aktivitet. Andre cellelinjer findes (PLB-98, NB4), og de er også forbundet med deres sæt af begrænsninger19.
Det er afgørende at validere med primære menneskelige neutrofiler observationer lavet med musesygdom modeller og cellelinjer. Neutrofiler kan ikke cryopreserved effektivt og dermed er ofte frisk isoleret fra fuldblod eller buffy frakker opnået fra donorer og straks behandles. Når de er isoleret, begynder cellerne at gennemgå en kompleks form for spontan død, reguleret af oxidation, cytoplasmaiske caspaser og proteaser fundet i neutrohilgranulat20,21. Forkert isolation metoder eller teknikker kan føre til aktivering af neutrofiler, kun accelererende celle død. Det er bydende nødvendigt at have en pålidelig og konsekvent metode til at opnå rene neutrofiler af høj kvalitet fra donorer.
Der har været mange metoder offentliggjort på human neutrohil isolation10,22. De falder hovedsageligt i to kategorier med nogle fælles strategier. Den første kategori er antistofbaseret, enten gennem positiv eller negativ udvælgelse. Positivt valg ville mærke neutrofiler direkte, derfor giver en meget ren cellepopulation, selv om det også fører til hurtig celleaktivering, celledød, samt uønsket mærkning af neutrofiler23. Negativ udvælgelse, selvom cellerne ikke er mærket og giver en meget ren population, accelererede neutrophildøden, selvom den præcise mekanisme er ukendt (Figur 5). Hvorvidt gen- eller proteinekspression også ændres efter positiv eller negativ udvælgelse skal undersøges yderligere. Desuden kan disse metoder på grund af mængden af antistof, der er nødvendig for at nedbryde de andre typer celler, ikke udsende store mængder neutrofiler. Antistofbaserede analyser kan dog stadig anvendes til kortsigtet kultur og eksperimenter i mindre skala og er foretrukne metoder til forsøg, der kræver meget høj cellerenhed, såsom gen- og proteinekspressionsundersøgelser.
Den anden type isolationsmetode er gradient- og tæthedsbaseret. Det involverer normalt Percoll, Ficoll-Paque, eller andre polysaccharid / polyvinylpyrrolidone komponenter og udnytter centrifugering kraft til at adskille forskellige typer af blodlegemer baseret på celletæthed. Disse metoder er ofte suppleret med sedimentering af røde blodlegemer ved dextran. Disse metoder kan håndtere større skalaer af udgangsmateriale og kan også opnå høj renhed. En advarsel om tæthedsbaseret isolation er den ineffektive adskillelse af andre langt mindre rigelige granulocytter (for det meste eosinofile) fra neutrofiler, og det er derfor den største begrænsning af den præsenterede protokol, da selv tilstedeværelsen af lille celleforurening kan påvirke neutrohilrespons24.
Præsenteret her er en opsummeret metode baseret på gradient isolation, raffinering tidligere metoder10,22. Vi udnytter den nuværende underdrivelse af neutrofiler til pålideligt at isolere rene menneskelige neutrofiler med begrænset resterende blodplade og RBCs, hvilket forhindrer neutrofil aktivering og accelereret død. Det mest afgørende skridt er lagdelingen af gradienten, som er meget mere effektivt opnået ved at tilføje densitet gradient medium under blodet for at opnå en skarp grænseflade. En hurtig undersøgelse af PBMC ringen og gradient efter centrifugering kan afsløre mulig forurening, aktivering, og lave udbytter. Når du arbejder med en leukapheresis membran eller buffy pels, fortynding af blodet er vigtigt, da overdreven celletæthed ville føre til cellesammenlægning, hvilket fører til urenheder og celleaktivering.
Denne protokol skal udfyldes inden for 2 timer for at sikre cellefriskhed, og trin, der involverer tætheden gradient medium, dextran, og lysis gøres straks, da eksponering for disse løsninger kan ændre neutrofiler. Med denne protokol, det forventede udbytte af neutrofiler er mindst ~ 10 millioner/10 mL af fuldblod og mindst ~ 60 millioner/10 mL buffy pels. Evaluering af isolationskvaliteten bør ske som følger: aktiverede neutrofiler skal være mindre end 10 %, lymfocytforurening lavere end 5 %, minimal eosinofil (samme sidespredning, men lavere fremadgående scatterpopulation), og celleens levedygtighed bør være over 90 %. Lavere renhed kan skyldes forkert lagdeling eller opbevaring af tæthedsgradientmediet eller på grund af kvaliteten og friskheden af startblodproduktet.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev støttet af P01HL095489. A.Y.H blev støttet af T32HL066987.
3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
CD41-APC | biolegend | 303710 | |
Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
Dextran | Fisher | BP1580 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
Sodium chloride | sigma | 71376 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |