Investigando comportamento semelhante à enxaqueca usando aversão à luz em camundongos
Summary
Roedores não são capazes de relatar sintomas de enxaqueca. Aqui, descrevemos um paradigma de teste gerenciável (ensaios de campo claro/escuro e aberto) para medir a aversão à luz, um dos sintomas mais comuns e incômodos em pacientes com enxaquecas.
Abstract
A enxaqueca é uma doença neurológica complexa caracterizada por dor de cabeça e anormalidades sensoriais, como a hipersensibilidade à luz, observada como fotofobia. Embora seja impossível confirmar que um rato está tendo enxaqueca, a aversão à luz pode ser usada como substituto comportamental para o sintoma de enxaqueca da fotofobia. Para testar a aversão à luz, utilizamos o ensaio claro/escuro para medir o tempo que os ratos optam livremente por passar em um ambiente claro ou escuro. O ensaio foi refinado introduzindo duas modificações críticas: pré-exposições à câmara antes de executar o procedimento de teste e iluminação de câmara ajustável, permitindo o uso de uma gama de intensidades de luz de 55 lux a 27.000 lux. Como a escolha de passar mais tempo no escuro também é um indicativo de ansiedade, também utilizamos um teste de ansiedade independente da luz, o ensaio de campo aberto, para distinguir a ansiedade do comportamento leve e aversivo. Aqui, descrevemos um paradigma de teste modificado para os ensaios de campo claro/escuro e aberto. A aplicação desses ensaios é descrita para injeção intraperitoneal de peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP) em duas cepas de camundongos e para estudos de estimulação cerebral optogenética.
Introduction
A enxaqueca é uma doença neurológica prevalente, afetando aproximadamente 17% dos americanos1 e é a segunda principal causa de incapacidade globalmente 2,3. Os pacientes experimentam dor de cabeça que dura de 4 a 72 horas acompanhadas de pelo menos um dos seguintes sintomas: náusea e/ou vômito, ou fotofobia e fonofobia4. Os recentes avanços no desenvolvimento de anticorpos de peptídeos relacionados com genes de calcitonina (CGRP) que agora são aprovados pela FDA iniciaram uma nova era para o tratamento da enxaqueca5,6,7. Esses anticorpos bloqueiam o CGRP ou seu receptor e previnem sintomas de enxaqueca em aproximadamente 50% dos pacientes com enxaqueca7. No último ano, dois antagonistas de pequenas moléculas do receptor CGRP também foram aprovados pela FDA para tratamento abortivo de enxaqueca, e mais dois estão no pipeline8. Apesar desse progresso terapêutico, os mecanismos pelos quais ocorrem os ataques de enxaqueca ainda permanecem evasivos. Por exemplo, os sites de ação CGRP não são conhecidos. A eficácia de anticorpos terapêuticos que não atravessam consideravelmente a barreira hematoencefálica sugere que o CGRP age em locais periféricos, como os meninges e/ou gânglios trigeminais. No entanto, não podemos descartar ações centrais em órgãos circunviculares, que não possuem uma barreira hemencefálica9. Pelo menos para fotofobia, achamos que isso é menos provável dado nossos resultados com aversão leve usando camundongos nestin/hRAMP1 transgênicos nos quais o hRAMP1 é superexpresso no tecido nervoso10. A compreensão dos mecanismos da fisiopatologia da enxaqueca fornecerá novos caminhos para o desenvolvimento da terapêutica da enxaqueca.
Modelos animais pré-clínicos são fundamentais para a compreensão dos mecanismos da doença e o desenvolvimento de novas drogas. No entanto, a avaliação da enxaqueca em animais é desafiadora, uma vez que os animais não podem relatar verbalmente suas sensações de dor. Dado o fato de que 80-90% dos pacientes com enxaqueca apresentam fotofobia11, a aversão à luz é considerada um indicador de enxaqueca em modelos animais. Isso levou à necessidade de desenvolver um ensaio para avaliar a aversão à luz em camundongos.
O ensaio claro/escuro contém uma zona de luz e uma zona escura. É amplamente utilizado para medir a ansiedade em camundongos com base em sua exploração espontânea de novos ambientes que é combatido por sua aversão inata à luz12. Alguns estudos definem 1/3 da câmara como a zona escura, enquanto outros definem 1/2 da câmara como a zona escura. O primeiro ambiente é frequentemente usado para detectar ansiedade13. Embora inicialmente tenhamos escolhido câmaras claras/escuras de tamanho igual, não comparamos os dois tamanhos relativos. Podemos comentar que o tamanho geral de ambas as câmaras não é um fator importante, uma vez que a caixa de testes iniciais14 foi consideravelmente maior do que o aparelho subsequente15, mas os resultados foram essencialmente os mesmos.
Duas modificações críticas neste ensaio claro/escuro para avaliar a aversão à luz foram: a condição de teste e a intensidade da luz (Figura 1). Primeiro, os camundongos são pré-expostos à câmara clara/escura para reduzir a unidade exploratória16 (Figura 1A). A necessidade e os tempos de pré-exposições dependem de cepas e modelos do rato. Os camundongos Wildtype C57BL/6J geralmente requerem duas pré-exposições10, enquanto apenas uma pré-exposição para camundongos CD1 é suficiente17. Desta forma, o comportamento aversivo da luz pode ser desmascarado nessas duas cepas de camundongos. Em segundo lugar, a iluminação da câmara foi adaptada para incluir uma gama ajustável de intensidades de luz de dim (55 lux) a brilhante (27.000 lux) onde 55 lux é comparável a um dia nublado escuro, e 27.000 lux é comparável a um dia ensolarado e ensolarado na sombra10. Descobrimos que a intensidade de luz necessária varia de acordo com a cepa e o modelo genético. Por essa razão, os indivíduos devem primeiro avaliar a intensidade mínima da luz para seu paradigma experimental.
Mesmo com essas modificações no ensaio, que podem revelar um fenótipo leve e aversivo, é necessário testar comportamentos semelhantes à ansiedade para distinguir entre a aversão à luz devido à luz apenas versus devido à ansiedade. O ensaio de campo aberto é uma forma tradicional de medir a ansiedade com base na exploração espontânea de novos ambientes. Difere do ensaio claro/escuro, pois a unidade exploratória é combatida pela aversão inata a espaços abertos desprotegidos. Tanto o centro quanto as bordas da câmara estão na luz, então o ensaio de campo aberto é um ensaio de ansiedade levemente independente. Assim, a combinação dos ensaios de campo claro/escuro e aberto nos permite distinguir entre a aversão à luz devido à prevenção da luz versus um aumento geral da ansiedade.
CGRP é um neuropeptídeo multifuncional que regula vasodilatação, nocicepção e inflamação18. É amplamente expressa nos sistemas nervosos periférico e central. Desempenha um papel importante na fisiopatologia da enxaqueca18. No entanto, o mecanismo subjacente à ação cgrp na enxaqueca não é claro. Utilizando os ensaios de campo claro/escuro e aberto com este paradigma de teste modificado, conseguimos identificar o comportamento aversivo em camundongos após a administração periférica 10,16 (Figura 2) e central14,15,16,19 CGRP. Além dos neuropeptídeos, a identificação de regiões cerebrais envolvidas na aversão à luz também é importante na compreensão da fisiopatologia da enxaqueca. Os núcleos talámicos posteriores são uma região cerebral integrativa para dor e processamento de luz19, e o tálamo é ativado durante a enxaqueca20. Assim, direcionamos núcleos tálammicos posteriores injetando vírus associado ao adeno (AAV) contendo canalrhodopsina-2 (ChR2) ou eYFP nesta região. Combinando essa abordagem optogenética com esses dois ensaios, demonstramos que a estimulação óptica de neurônios expressos de ChR2 nos núcleos talâmicos posteriores induziu a aversão à luz19 (Figura 3). Neste experimento, dado o efeito dramático sobre a aversão à luz evocada nesses ratos optogeneticamente manipulados, pré-exposições à câmara foram ignoradas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio claro/escuro é amplamente utilizado para avaliar comportamentos semelhantes à ansiedade12. O ensaio conta com a aversão inata dos ratos à luz e sua vontade de explorar quando colocados em um novo ambiente (zona de luz). No entanto, como relatamos aqui, este ensaio também pode ser usado para avaliar o comportamento aversivo da luz também.
É fundamental considerar o número e a necessidade de pré-exposições antes dos testes. Isso depende da tensão do m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subvenções do NIH NS R01 NS075599 e RF1 NS113839. Os conteúdos não representam as opiniões da VA ou do Governo dos Estados Unidos.
Materials
| Activity monitor | Med Assoc. Inc | Software tracking mouse behavior | |
| Customized acrylic shelf | For adjusting the height of the LED panel | ||
| Dark box insert | Med Assoc. Inc | ENV-511 | |
| DC power supply | Med Assoc. Inc | SG-500T | |
| DC regulated power supply | Med Assoc. Inc | SG-506 | |
| Fiber-optic cannula | Doric | MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT | |
| Germicidal disposable wipes | Sani-Cloth | SKU # Q55172 | |
| Heat Sink | Wakefield | 490-6K | Connecting to LED panel |
| IR controller power cable | Med Assoc. Inc | SG-520USB-1 | |
| IR USB controller | Med Assoc. Inc | ENV-520USB | |
| Mating sleeve | Doric | SLEEVE_ZR_1.25 | |
| Modified LED light panel | Genaray Spectro | SP-E-360D | Daylight-balanced color (5600K) |
| Power supply | MEAN WELL USA | SP-320-12 | Connecting to LED panel |
| Seamless open field chamber | Med Assoc. Inc | ENV-510S | |
| Sound-attenuating cubicle | Med Assoc. Inc | ENV-022MD-027 | |
| Stand and clamp | |||
| Three 16-beam IR arrays | Med Assoc. Inc | ENV-256 |
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