Medição da Composição do Complexo de Sinalização e Processamento de Indução de Morte CD95 de Procaspase-8 neste Complexo

Resumo

Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho experimental que permite a detecção do processamento caspase-8 diretamente no complexo de sinalização indutor de morte (DISC) e determina a composição desse complexo. Essa metodologia possui amplas aplicações, desde a desvendação dos mecanismos moleculares das vias de morte celular até a modelagem dinâmica das redes de apoptose.

Resumo

A apoptose extrínseca é mediada pela ativação de receptores de morte (DRs) como CD95/Fas/APO-1 ou ligante indutor de fator de necrose tumoral (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). A estimulação desses receptores com seus ligantes cognatos leva à montagem do complexo de sinalização indutor da morte (DISC). O DISCO compreende dr, a proteína adaptadora Fas com domínio de morte (FADD), procaspases-8/-10, e interleucina semelhante a FADD celular (IL)-1β-conversão de proteínas inibitórias de enzimas (c-FLIPs). O DISCO serve como uma plataforma para processamento e ativação procaspase-8. Este último ocorre por meio de sua dimerização/oligomerização nos filamentos de domínio de efeito de morte (DED) montados no DISC.

A ativação do procaspase-8 é seguida pelo seu processamento, que ocorre em várias etapas. Neste trabalho, descreve-se um fluxo de trabalho experimental estabelecido que permite a medição da formação de DISC e o processamento do procaspase-8 neste complexo. O fluxo de trabalho é baseado em técnicas de imunoprecipitação apoiadas pela análise de manchas ocidentais. Este fluxo de trabalho permite um monitoramento cuidadoso de diferentes etapas do recrutamento procaspase-8 para o DISCO e seu processamento e é altamente relevante para investigar mecanismos moleculares de apoptose extrínseca.

Introdução

Um dos receptores de morte (DRs) mais bem estudados é o CD95 (Fas, APO-1). A via poptótica extrínseca começa com a interação do DR com seu ligante cognato, ou seja, o CD95L interage com cd95 ou trail liga-Rs. Isso resulta na formação do DISCO no DR. DISC correspondente composto por CD95, FADD, procaspase-8/-10 e proteínas c-FLIP^1,2. Além disso, o DISCO é montado por interações entre proteínas contendo domínio de morte (DD), como CD95 e FADD, e proteínas contendo DED, como FADD, procaspase-8/-10 e c-FLIP(Figura 1). O Procaspase-8 passa por oligomerização via assoc....

Protocolo

Os experimentos com células T foram realizados de acordo com o acordo ético 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparando células para o experimento

NOTA: O número médio de células para esta imunoprecipitação é de 1 × 10⁷_. Células aderentes devem ser semeadas um dia antes do experimento para que haja 1 × 10⁷ células no dia do experimento.

1. Preparando células aderentes para o experimento
   1. Semente 5-8 × 10⁶ células aderentes em 20 mL de meio (ver a Tabela de Materiais para a composição) para cada condição em pratos de 14,5 cm um dia antes do início ....

Resultados

Para analisar o recrutamento caspase-8 para o DISCO e seu processamento no DISCO CD95, este artigo descreve um fluxo de trabalho clássico, que combina IP do CD95 DISC com análise de manchas ocidentais. Isso permite a detecção de várias características-chave da ativação caspase-8 no DISCO: a montagem da plataforma macromolecular ativante caspase-8, o recrutamento do procaspase-8 para o DISCO e o processamento desta caspase iniciadora(Figura 1 e Figura 2). Este fl.......

Discussão

Esta abordagem foi descrita pela primeira vez por Kischkel et al.²⁷ e foi desenvolvida com sucesso desde então por vários grupos. Várias questões importantes devem ser consideradas para a eficiente imunoprecipitação disc-imunoprecipitação e monitoramento do processamento caspase-8 neste complexo.

Em primeiro lugar, é essencial seguir todas as etapas de lavagem durante a imunoprecipitação. Especialmente importantes são as etapas finais de lavagem das contas de sepharose .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
12,5% de gel SDS		por si mesmo	para dois géis separadores: 3,28 mL destilado H2O 2,5 mL Tris; pH 8,8; 1,5 M 4,06 mL acrilamida 100 µ L 10% SDS 100 µ L 10% APS 7,5 µ L TEMED para dois géis coletores: 3,1 mL de H2O 1,25 mL de Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,5 mL de acrilamida 50 µ L 10% SDS 25 µ L 10% APS 7,5 µ L TEMED
14,5 cm pratos de células	Greiner	639160
acrilamida	Carl Roth	A124.1
Pontas de pipeta de filtro de aerossol com filtro de alta recuperação e orifício largo	VWR	46620-664 (América do Norte) ou 732-0559 (Europa)	Usado para pipetar grânulos para o lisado
anti-actina Ab	Sigma Aldrich	A2103	diluição: 1:4000 em PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	fornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido por Enzo	ALX-805-038-C100	usado apenas para imunoprecipitação
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	diluição: 1:1000 em PBST + 1:100 NaN3
>anti-caspase-3 Sinalização	de células	9662 S	diluição: 1:2000 em PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15	fornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido por ENZO	ALX-804-242-C100	diluição: 1:20 em PBST + 1:100 NaN3
>anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	diluição: 1:2000 em PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	fornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido por ENZO	ALX-804-961-0100	diluição: 1:10 em PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	fornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido por ENZO	ADI-AAM-212-E	diluição: 1:10 em PBST + 1:100 NaN3
>anti-PARP Sinalização	de células	9542	diluição: 1:1000 em PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoetanol	Carl Roth	4227.2
Solução de Bradford Concentrado de Reagente de Corante de Ensaio de Proteína 450ml	Bio Rad	500-0006	usado de acordo com as instruções do fabricante
CD95L	fornecidas nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido pelo	ALX-522-020-C005
Chem Doc XRS+	Bio Rad
Coquetel Inibidor de Protese Completo (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	preparado de acordo com as instruções do fabricante
DPBS (10x) sem Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	diluição 1:10 com H2O, armazenamento no
tampão de eletroforese	de geladeira de fabricação		própria10x tampão de eletroforese: 60,6 g Tris 288 g glicina 20 g SDS ad 2 L H2O diluição 1:10 antes do uso
glicina	Carl Roth	3908.3
Cabra Anti-Rato IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	diluição 1:10.000 em PBST + 5% leite
Cabra Anti-Rato IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	diluição 1:10.000 pol PBST + 5% de leite
de cabra Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	diluição 1:10.000 em PBST + 5% de leite
Interleucina-2 Humana (hIL-2)	Merckgroup / Roche	11011456001	para ativação de células T
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2< / sub>PO4< / sub>	Carl Roth	3904.1
tampão de carga 4x Tampão de amostra Laemmli, 10 mL	Bio Rad	161-0747	preparado de acordo com as instruções do fabricante
Substrato Luminata Forte Western HRP	Tampão	WBLUFO500
	auto-fabricado		13,3 mL Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M 27,5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 adicionar 960 mL H2O
meio para células adhaerent DMEM F12 (1:1) w glutamina estável,  2.438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	adicionando 10% FCS, 1% Penicilina-Estreptomicina e 0.0001% Puromicina ao meio
para células T primárias	gibco da Life Technologie	21875034	adicionando 10% FCS e 1% Penicilina-Estreptomicina ao
meio leite em pó	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	auto-fabricado		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56,8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O diluição 1:20 antes do uso
PBST + 5% de leite	self-made		50 g de leite em pó + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	para ativação de células T
Power Pac HC Bio	Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	use entre 3-5 e micro; L
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	grânulos de resina de afinidade preparados de acordo com as instruções do fabricante
raspador	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
shaker	Heidolph
azida sódica	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo pilhas de transferência de tamanho mini	Bio Rad	170-4270	usado de acordo com as instruções do fabricante
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	preparado de acordo com as instruções do fabricante
TransBlot Turbo Membrana de nictrocelulose de tamanho mini	Bio Rad	170-4270	usado de acordo com as instruções do fabricante
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000

feito Ab Ab detector de quimioluminescência ENZO de lise Millipore