הכנת מיקרוקפסולות רב תכליתיות על בסיס משי עמוסות בפלסמידים DNA המקודדים RNA Aptamers ו-Riboswitches
Summary
הפרוטוקול מתאר את היווצרותן של מיקרו-קפסולות חזקות ועמוסות DNA תואמות ביולוגית כחיישנים ביולוגיים מרובי מבחנה המסוגלים לעקוב אחר מספר ליגנדות.
Abstract
אנו מציגים פרוטוקול להכנת מיקרו-קפסולות משי פיברואין עמוסות DNA באמצעות שיטת ההרכבה Layer-by-Layer (LbL) על ליבות כדוריות להקרבה. לאחר ספיחה של שכבה ראשונית ופלסמידים של DNA, היווצרות מיקרוקפסולות חזקות התאפשרה על ידי השראת יריעות β במבנה משני משי במהלך התייבשות חריפה של שכבת משי יחידה. לפיכך, השכבות התרחשו באמצעות קשרי מימן מרובים ואינטראקציות הידרופוביות. עם ספיחה של פגזים רב-שכבתיים, מבני מעטפת הליבה יכולים לתפקד עוד יותר עם ננו-חלקיקי זהב (AuNPs) ו / או נוגדנים (IgG) שישמשו לחישה מרחוק ו / או משלוח ממוקד. התאמת מספר פרמטרים מרכזיים במהלך שיקוע רציף של מקרומולקולות מפתח על ליבות סיליקה כגון נוכחות פריימר פולימרי, ריכוז הדנ”א וחלבון המשי, כמו גם מספר שכבות נספגות, הביאה למיקרו-קפסולות תואמות ביולוגית, עמוסות DNA עם חדירות משתנה ועומסי DNA. עם המסת ליבות סיליקה, הפרוטוקול הדגים היווצרות של מיקרוקפסולות חלולות וחזקות עם פלסמידים DNA משותקים על פני השטח הפנימיים של קרום הקפסולה. יצירת קרום תואם ביולוגית חדיר באופן סלקטיבי בין פלסמידים של הדנ”א לסביבה החיצונית שימרה את הדנ”א במהלך אחסון ארוך טווח ומילאה תפקיד חשוב בתגובת פלט משופרת מפלסמידים מוגבלים מרחבית. פעילותן של תבניות DNA ונגישותן נבדקו במהלך שעתוק חוץ גופי ותגובות תרגום (מערכות נטולות תאים). פלסמידים של DNA המקודדים RNA Light Light aptamers ו riboswitches הופעלו בהצלחה עם אנליטים מתאימים, כפי שהודגם במהלך לוקליזציה של תעתיקי RNA המסומנים באופן פלואורסצנטי או חלבון GFPa1 בקרומי הקליפה.
Introduction
תחום הביולוגיה הסינתטית מציע הזדמנויות ייחודיות לפיתוח יכולות חישה על ידי ניצול מנגנונים טבעיים שפותחו על ידי מיקרואורגניזמים כדי לנטר את סביבתם ואת האיומים הפוטנציאליים שלהם. חשוב לציין שמנגנוני חישה אלה קשורים בדרך כלל לתגובה המגנה על מיקרואורגניזמים אלה מפני חשיפה מזיקה, ומווסתת את ביטוי הגנים כדי למתן השפעות שליליות או למנוע צריכה של חומרים רעילים. נעשו מאמצים משמעותיים להנדס מיקרואורגניזמים אלה כדי ליצור חיישנים של תאים שלמים המנצלים את התגובות הטבעיות הללו, אך מכוונים אותן מחדש לזהות מטרות חדשות ו/או לייצר אות מדיד שניתן למדוד למטרות כימות (בדרך כלל פלואורסצנטיות)1,2. כיום, חששות לגבי השימוש במיקרואורגניזמים מהונדסים גנטית (GMOs), במיוחד כאשר הם משוחררים בסביבה או בגוף האדם, עקב דליפה של תאים שלמים או חלק מהחומר הגנטי שלהם, גם אם הם עטופים במטריצה פולימרית, מציעים כי יש צורך בדרכים חלופיות לנצל גישות חישה אלה3.
גישה רבת עוצמה לניצול היתרונות של חישה מבוססת מיקרואורגניזמים ללא דאגה לפריסה של הנדסה גנטית היא השימוש במערכות שעתוק / תרגום חוץ גופי (IVTT). מבחינה מעשית, מערכות IVTT מורכבות מתערובת המכילה את רוב מרכיבי התא במצב פעיל ש”חולץ” מהתאים באמצעים שונים, כולל סוניקציה, הכאת חרוזים או אחרים4. התוצר הסופי של תהליך זה הוא תערובת תגובה ביוכימית שכבר הותאמה לביצוע שעתוק ותרגום, שניתן להשתמש בה כדי לבדוק חיישנים שונים בפורמט “כלי פתוח”, ללא האילוצים הקשורים לשימוש בתאים שלמים (דיפוזיה של ממברנה, יעילות טרנספורמציה, רעילות תאים וכו ‘). חשוב לציין, ניתן להוסיף רכיבי חיישנים שונים באופן כמותי, והשפעתם נחקרת בטכניקות אופטיות וספקטרומטריות שונות, כפי שהדגמנו5. זה כבר שם לב כי הביצועים של מערכות IVTT יכול להיות עקבי; עם זאת, מחקרים אחרונים הראו גישות לסטנדרטיזציה של ההכנה והאפיון שלהם, וזה עוזר מאוד כאשר לומדים את הביצועים שלהם בעיצוב חיישנים6. לאחרונה הודגמו דוגמאות רבות של מערכות IVTT המשמשות ליצירת בדיקות מבוססות נייר באמצעות ליופיליזציה של מרכיביהן במטריצות נייר, כולל זיהוי יוני מתכות כבדות, תרופות, אלמנטים של חישת מניין ואחרים 7,8,9. מרחב יישומים מרגש עבור חיישנים מבוססי IVTT הוא השימוש בהם ביישומי חישה בסוגים שונים של סביבות, כולל אדמה, מים וגוף האדם. על מנת לפרוס מערכות IVTT אלה בסביבות מאתגרות אלה, יש ליישם גישת אנקפסולציה כדי להכיל את רכיבי IVTT ולהגן עליהם מפני התפרקות.
גישות האנקפסולציה הנפוצות ביותר עבור מערכות IVTT כוללות שימוש בכמוסות שומנים, מיצלים, פולימרזומים ומיקרו-מיכלים סגורים אחרים10,11,12. חיסרון אחד של גישה זו הוא הצורך לשלב מנגנונים פסיביים או אקטיביים להובלת חומרים פנימה והחוצה מהמכולות כדי לאפשר תקשורת עם הסביבה החיצונית ולספק יכולות חישה. כדי להתגבר על חלק מבעיות אלה, המחקר כאן מדווח על שיטה המספקת גישה פשוטה אך יעילה לתמצת את חומרי הקידוד עבור עיצובי חיישנים שונים שיבואו לידי ביטוי במערכות IVTT. גישה זו מבוססת על שימוש בתצהיר שכבה אחר שכבה (LbL) של ביופולימר בנוכחות הפלסמידים המעניינים ליצירת מיקרוקפסולות חלולות עם נקבוביות גבוהה, המאפשרת לחומר הגנטי המוגן לקיים אינטראקציה עם המרכיבים השונים של ה- IVTT לפי בחירה. המחקר הראה כי פלסמידים עטופים יכולים לכוון שעתוק ותרגום כאשר הם מופעלים בתוך מטריצה פולימרית זו, כפי שמוצג עם התגובה של אפטמר מקודד פלסמיד וריבומתג למטרות המתאימות שלהם. בנוסף, ציפוי LbL זה מגן על הפלסמידים למשך חודשים ללא תנאי אחסון מיוחדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתן להכין מיקרו-קפסולות הידרוג’ל חדירות באופן סלקטיבי העמוסות בסוגים שונים של עיצובי חיישנים המקודדים בדנ”א בעקבות פרוטוקול זה. אחד המאפיינים הייחודיים של גישת LbL הוא היכולת להתאים את המורכבות של מיקרוקפסולות במהלך ההרכבה מלמטה למעלה, אשר בדרך כלל מתחיל עם ספיחה של מינים מולקולריים על ת?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק LRIR 16RH3003J ממשרד חיל האוויר למחקר מדעי, כמו גם על ידי ביולוגיה סינתטית לסביבות צבאיות מחקר יישומי לקידום סדרי עדיפויות S&T (ARAP) של המשרד האמריקני של תת מזכיר ההגנה למחקר והנדסה.
רצף וקטור הפלסמיד עבור ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) סופק בנדיבות על ידי ד”ר ג’יי גליבן. פקעות תולעי משי מבומביקס מורי נתרמו בנדיבות על ידי ד”ר ד.ל. קפלן מאוניברסיטת טאפטס, מסצ’וסטס.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
Referências
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B., Reischl, U. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. 13, 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
