डीएनए प्लास्मिड एन्कोडिंग आरएनए एपटामर और राइबोस्विच से भरे बहुक्रियाशील रेशम-आधारित माइक्रोकैप्सूल की तैयारी
Summary
प्रोटोकॉल में मजबूत और बायोकंपैटिबल डीएनए से भरे माइक्रोकैप्सूल के गठन का वर्णन किया गया है, जो कई लिगेंड को ट्रैक करने में सक्षम मल्टीप्लेक्स इन विट्रो बायोसेंसर के रूप में है।
Abstract
हम बलिदान गोलाकार कोर पर परत-दर-परत (एलबीएल) असेंबली विधि के माध्यम से डीएनए से भरे रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। एक प्रमुख परत और डीएनए प्लास्मिड के सोखने के बाद, एक एकल रेशम परत के तीव्र निर्जलीकरण के दौरान रेशम द्वितीयक संरचना में β-शीट को प्रेरित करके मजबूत माइक्रोकैप्सूल के गठन की सुविधा प्रदान की गई थी। इसलिए, लेयरिंग कई हाइड्रोजन बॉन्डिंग और हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के माध्यम से हुई। बहुस्तरीय गोले के सोखने पर, कोर-शेल संरचनाओं को रिमोट सेंसिंग और / या लक्षित वितरण के लिए उपयोग किए जाने वाले सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) और / या एंटीबॉडी (आईजीजी) के साथ आगे कार्यात्मक बनाया जा सकता है। सिलिका कोर पर प्रमुख मैक्रोमोलेक्यूल्स के अनुक्रमिक जमाव के दौरान कई प्रमुख मापदंडों को समायोजित करना जैसे कि बहुलक प्राइमर की उपस्थिति, डीएनए और रेशम प्रोटीन की एकाग्रता, साथ ही साथ कई अधिशोषित परतों के परिणामस्वरूप परिवर्तनीय पारगम्यता और डीएनए लोडिंग के साथ जैव-संगत, डीएनए से भरे माइक्रोकैप्सूल होते हैं। सिलिका कोर के विघटन पर, प्रोटोकॉल ने कैप्सूल झिल्ली की आंतरिक सतह पर डीएनए प्लास्मिड के साथ खोखले और मजबूत माइक्रोकैप्सूल के गठन का प्रदर्शन किया। डीएनए प्लास्मिड और बाहरी वातावरण के बीच एक चुनिंदा पारगम्य जैव-संगत झिल्ली बनाने से डीएनए को दीर्घकालिक भंडारण के दौरान संरक्षित किया गया और स्थानिक रूप से सीमित प्लास्मिड से बेहतर आउटपुट प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई गई। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद प्रतिक्रियाओं (सेल-फ्री सिस्टम) के दौरान डीएनए टेम्प्लेट की गतिविधि और उनकी पहुंच का परीक्षण किया गया था। आरएनए लाइट-अप एपटामर और राइबोस्विच को एन्कोडिंग करने वाले डीएनए प्लास्मिड को संबंधित विश्लेषणों के साथ सफलतापूर्वक सक्रिय किया गया था, जैसा कि शेल झिल्ली में फ्लोरोसेंटली लेबल आरएनए ट्रांस्क्रिप्ट या जीएफपीए 1 प्रोटीन के स्थानीयकरण के दौरान कल्पना की गई थी।
Introduction
सिंथेटिक जीव विज्ञान का क्षेत्र सूक्ष्मजीवों द्वारा विकसित प्राकृतिक तंत्र का दोहन करके संवेदन क्षमताओं को विकसित करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है ताकि उनके पर्यावरण और संभावित खतरों की निगरानी की जा सके। महत्वपूर्ण रूप से, ये संवेदन तंत्र आम तौर पर एक प्रतिक्रिया से जुड़े होते हैं जो इन सूक्ष्मजीवों को हानिकारक जोखिम से बचाता है, नकारात्मक प्रभावों को कम करने या विषाक्त पदार्थों के सेवन को रोकने के लिए जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करता है। इन प्राकृतिक प्रतिक्रियाओं का लाभ उठाते हुए पूरे सेल सेंसर बनाने के लिए इन सूक्ष्मजीवों को इंजीनियर करने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास किए गए हैं, लेकिन उन्हें नए लक्ष्यों को पहचानने और / या एक औसत दर्जे का संकेत उत्पन्न करने के लिए फिर से निर्देशित किया गया है जिसे परिमाणीकरण उद्देश्यों (आमतौर पर प्रतिदीप्ति) 1,2 के लिए मापा जा सकता है। वर्तमान में, आनुवंशिक रूप से संशोधित सूक्ष्मजीवों (जीएमओ) के उपयोग के साथ चिंताएं, विशेष रूप से जब पर्यावरण या मानव शरीर में जारी होती हैं, पूरी कोशिकाओं या उनकी कुछ आनुवंशिक सामग्री के रिसाव के कारण, भले ही बहुलक मैट्रिक्स में समझाया गया हो, सुझाव देते हैं कि इन संवेदन दृष्टिकोणों का फायदा उठाने के वैकल्पिक तरीकोंकी आवश्यकता है।
जीएमओ की तैनाती की चिंता के बिना सूक्ष्मजीव-आधारित संवेदन के लाभों का फायदा उठाने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन / अनुवाद (आईवीटीटी) सिस्टम का उपयोग है। एक व्यावहारिक दृष्टिकोण से, आईवीटीटी सिस्टम में एक मिश्रण होता है जिसमें एक सक्रिय अवस्था में अधिकांश सेल घटक होते हैं जिन्हें विभिन्न माध्यमों से कोशिकाओं से “निकाला” जाता है, जिसमें सोनिकेशन, बीड-बीटिंग या अन्य4 शामिल हैं। इस प्रक्रिया का अंतिम उत्पाद एक जैव रासायनिक प्रतिक्रिया मिश्रण है जो पहले से ही प्रतिलेखन और अनुवाद करने के लिए अनुकूलित है जिसका उपयोग पूरे कोशिकाओं (झिल्ली प्रसार, परिवर्तन दक्षता, सेल विषाक्तता, आदि) के उपयोग से जुड़ी बाधाओं के बिना “खुले पोत” प्रारूप में विभिन्न सेंसर का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, विभिन्न सेंसर घटकों को मात्रात्मक रूप से जोड़ा जा सकता है, और उनके प्रभाव का अध्ययन विभिन्न ऑप्टिकल और स्पेक्ट्रोमेट्रिक तकनीकों द्वारा किया जाता है, जैसा किहमने 5 का प्रदर्शन किया है। यह देखा गया है कि आईवीटीटी सिस्टम का प्रदर्शन असंगत हो सकता है; हालांकि, हाल के अध्ययनों ने उनकी तैयारी और लक्षण वर्णन को मानकीकृत करने के लिए दृष्टिकोण दिखाए हैं, जो सेंसर डिजाइन6 में उनके प्रदर्शन का अध्ययन करते समय बहुत मदद करता है। हाल ही में, पेपर मैट्रिसेस में अपने घटकों के लियोफिलाइजेशन के माध्यम से पेपर-आधारित परख बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले आईवीटीटी सिस्टम के कई उदाहरणों का प्रदर्शन किया गया है, जिसमें भारी धातु आयनों, दवाओं, कोरम सेंसिंग तत्वों और अन्य 7,8,9 का पता लगाना शामिल है। आईवीटीटी-आधारित सेंसर के लिए एक रोमांचक अनुप्रयोग स्थान मिट्टी, पानी और मानव शरीर सहित विभिन्न प्रकार के वातावरण में संवेदन अनुप्रयोगों में उनका उपयोग है। इन चुनौतीपूर्ण वातावरणों में इन आईवीटीटी प्रणालियों को तैनात करने के लिए, आईवीटीटी घटकों को शामिल करने और उन्हें क्षरण से बचाने के लिए एक एनकैप्सुलेशन दृष्टिकोण को लागू करने की आवश्यकता है।
आईवीटीटी सिस्टम के लिए सबसे आम एनकैप्सुलेशन दृष्टिकोण में लिपिड कैप्सूल, मिसेल, पॉलिमरसोम और अन्य कसकर संलग्न माइक्रोकंटेनर10,11,12 का उपयोग शामिल है। इस दृष्टिकोण का एक नुकसान बाहरी वातावरण के साथ संचार की अनुमति देने और संवेदन क्षमताओं को प्रदान करने के लिए कंटेनरों के अंदर और बाहर सामग्री परिवहन के लिए निष्क्रिय या सक्रिय तंत्र को शामिल करने की आवश्यकता है। इनमें से कुछ मुद्दों को दूर करने के लिए, अध्ययन यहां एक विधि की रिपोर्ट करता है जो आईवीटीटी सिस्टम में व्यक्त किए जाने वाले विभिन्न सेंसर डिजाइनों के लिए एन्कोडिंग सामग्री को समाहित करने के लिए एक सरल लेकिन प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण उच्च छिद्र के साथ खोखले माइक्रोकैप्सूल बनाने के लिए रुचि के प्लास्मिड की उपस्थिति में एक बायोपॉलिमर के परत-दर-परत (एलबीएल) जमाव के उपयोग पर आधारित है, जो संरक्षित आनुवंशिक सामग्री को पसंद के आईवीटीटी के विभिन्न घटकों के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है। अध्ययन से पता चला है कि इस बहुलक मैट्रिक्स के भीतर सक्रिय होने पर एनकैप्सुलेटेड प्लास्मिड प्रतिलेखन और अनुवाद को निर्देशित कर सकते हैं, जैसा कि प्लास्मिड-एन्कोडेड एपटामर और उनके संबंधित लक्ष्यों के लिए राइबोस्विच की प्रतिक्रिया के साथ दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, यह एलबीएल कोटिंग किसी भी विशेष भंडारण स्थितियों के बिना महीनों तक प्लास्मिड की रक्षा करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विभिन्न प्रकार के डीएनए-एन्कोडेड सेंसर डिजाइनों से भरे चुनिंदा पारगम्य हाइड्रोगेल माइक्रोकैप्सूल इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए तैयार किए जा सकते हैं। एलबीएल दृष्टिकोण की विशिष्ट विशेषताओं में से ए…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को वायु सेना के वैज्ञानिक अनुसंधान कार्यालय से एलआरआईआर 16 आरएच 3003 जे अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, साथ ही अनुसंधान और इंजीनियरिंग के लिए रक्षा के अवर सचिव के अमेरिकी कार्यालय के एस एंड टी प्राथमिकताओं की उन्नति (एआरएपी) कार्यक्रम के लिए सैन्य वातावरण एप्लाइड रिसर्च के लिए सिंथेटिक जीवविज्ञान द्वारा समर्थित किया गया था।
थाइआरएस (पीएसएएलवी-आरएस-जीएफपीए 1, 3.4 केबी) के लिए प्लास्मिड वेक्टर अनुक्रम डॉ जे गैलिवन द्वारा उदारतापूर्वक प्रदान किया गया था। बोम्बिक्स मोरी के रेशम कीट कोकून को टफ्ट्स विश्वविद्यालय, एमए के डॉ डीएल कपलान द्वारा उदारतापूर्वक दान किया गया था।
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
Referências
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