Preparazione di microcapsule multifunzionali a base di seta caricate con plasmidi di DNA codificanti aptameri e ribointerruttori RNA
Summary
Il protocollo descrive la formazione di microcapsule robuste e biocompatibili cariche di DNA come biosensori in vitro multiplex in grado di tracciare diversi ligandi.
Abstract
Introduciamo un protocollo per la preparazione di microcapsule di fibroina di seta cariche di DNA tramite il metodo di assemblaggio Layer-by-Layer (LbL) su nuclei sferici sacrificali. Dopo l’adsorbimento di uno strato primario e plasmidi di DNA, la formazione di microcapsule robuste è stata facilitata inducendo fogli di β nella struttura secondaria della seta durante la disidratazione acuta di un singolo strato di seta. Quindi, la stratificazione è avvenuta tramite legami idrogeno multipli e interazioni idrofobiche. Dopo l’adsorbimento di gusci multistrato, le strutture del guscio centrale possono essere ulteriormente funzionalizzate con nanoparticelle d’oro (AuNP) e / o anticorpi (IgG) da utilizzare per il telerilevamento e / o la consegna mirata. La regolazione di diversi parametri chiave durante la deposizione sequenziale di macromolecole chiave su nuclei di silice come la presenza di un primer polimerico, la concentrazione di DNA e proteine della seta, nonché un numero di strati adsorbiti ha portato a microcapsule biocompatibili, cariche di DNA con permeabilità e carichi di DNA variabili. Dopo la dissoluzione dei nuclei di silice, il protocollo ha dimostrato la formazione di microcapsule cave e robuste con plasmidi di DNA immobilizzati sulla superficie interna della membrana della capsula. La creazione di una membrana biocompatibile selettivamente permeabile tra i plasmidi del DNA e l’ambiente esterno ha preservato il DNA durante la conservazione a lungo termine e ha svolto un ruolo importante nel miglioramento della risposta di uscita dai plasmidi spazialmente confinati. L’attività dei modelli di DNA e la loro accessibilità sono state testate durante le reazioni di trascrizione e traduzione in vitro (sistemi cell-free). I plasmidi del DNA che codificano aptameri e riboswitch di illuminazione dell’RNA sono stati attivati con successo con analiti corrispondenti, come è stato visualizzato durante la localizzazione di trascritti di RNA marcati con fluorescenza o proteina GFPa1 nelle membrane del guscio.
Introduction
Il campo della biologia sintetica offre opportunità uniche per sviluppare capacità di rilevamento sfruttando meccanismi naturali evoluti dai microrganismi per monitorare il loro ambiente e le potenziali minacce. È importante sottolineare che questi meccanismi di rilevamento sono tipicamente legati a una risposta che protegge questi microrganismi dall’esposizione dannosa, regolando l’espressione genica per mitigare gli effetti negativi o prevenire l’assunzione di materiali tossici. Ci sono stati sforzi significativi per progettare questi microrganismi per creare sensori a cellule intere sfruttando queste risposte naturali ma reindirizzandoli a riconoscere nuovi bersagli e / o a produrre un segnale misurabile che può essere misurato a fini di quantificazione (tipicamente fluorescenza)1,2. Attualmente, le preoccupazioni relative all’uso di microrganismi geneticamente modificati (OGM), specialmente quando vengono rilasciati nell’ambiente o nel corpo umano, a causa della fuoriuscita di cellule intere o di parte del loro materiale genetico, anche se incapsulato in una matrice polimerica, suggeriscono che sono necessari modi alternativi per sfruttare questi approcci di rilevamento3.
Un approccio efficace per sfruttare i vantaggi del rilevamento basato su microrganismi senza preoccuparsi della diffusione di OGM è l’uso di sistemi di trascrizione/traduzione in vitro (IVTT). Da un punto di vista pratico, i sistemi IVTT consistono in una miscela contenente la maggior parte dei componenti cellulari in uno stato attivo che è stata “estratta” dalle cellule con diversi mezzi, tra cui sonicazione, battito di perline o altri4. Il prodotto finale di questo processo è una miscela di reazione biochimica già ottimizzata per eseguire la trascrizione e la traduzione che può essere utilizzata per testare diversi sensori in un formato “open vessel”, senza i vincoli associati all’uso di cellule intere (diffusione di membrana, efficienza di trasformazione, tossicità cellulare, ecc.). È importante sottolineare che diversi componenti del sensore possono essere aggiunti quantitativamente e il loro effetto studiato con diverse tecniche ottiche e spettrometriche, come abbiamo dimostrato5. È stato notato che le prestazioni dei sistemi IVTT possono essere incoerenti; Tuttavia, studi recenti hanno mostrato approcci per standardizzare la loro preparazione e caratterizzazione, il che è di grande aiuto quando si studiano le loro prestazioni nella progettazione dei sensori6. Recentemente, sono stati dimostrati molti esempi di sistemi IVTT che utilizzano per creare saggi cartacei attraverso la liofilizzazione dei loro componenti in matrici cartacee, tra cui il rilevamento di ioni di metalli pesanti, farmaci, elementi di quorum sensing e altri 7,8,9. Uno spazio applicativo interessante per i sensori basati su IVTT è il loro utilizzo in applicazioni di rilevamento in diversi tipi di ambienti, tra cui suolo, acqua e corpo umano. Per distribuire questi sistemi IVTT in questi ambienti difficili, è necessario implementare un approccio di incapsulamento per contenere i componenti IVTT e proteggerli dal degrado.
Gli approcci di incapsulamento più comuni per i sistemi IVTT includono l’uso di capsule lipidiche, micelle, polimerisomi e altri microcontenitori strettamente chiusi10,11,12. Uno svantaggio di questo approccio è la necessità di incorporare meccanismi passivi o attivi per trasportare materiali dentro e fuori i contenitori per consentire la comunicazione con l’ambiente esterno e fornire capacità di rilevamento. Per superare alcuni di questi problemi, lo studio riporta un metodo che fornisce un approccio semplice ma efficace per incapsulare i materiali di codifica per diversi progetti di sensori da esprimere nei sistemi IVTT. Questo approccio si basa sull’utilizzo della deposizione Layer-by-Layer (LbL) di un biopolimero in presenza dei plasmidi di interesse per creare microcapsule cave ad alta porosità, che consente al materiale genetico protetto di interagire con i diversi componenti dell’IVTT di scelta. Lo studio ha dimostrato che i plasmidi incapsulati potrebbero dirigere la trascrizione e la traduzione quando attivati all’interno di questa matrice polimerica, come mostrato con la risposta di un aptamero codificato da plasmide e di un riboswitch ai loro bersagli corrispondenti. Inoltre, questo rivestimento LbL protegge i plasmidi per mesi senza particolari condizioni di conservazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le microcapsule di idrogel selettivamente permeabili caricate con vari tipi di sensori codificati dal DNA possono essere preparate seguendo questo protocollo. Una delle caratteristiche distintive dell’approccio LbL è la capacità di adattare la complessità delle microcapsule durante l’assemblaggio bottom-up, che di solito inizia con l’adsorbimento di specie molecolari su modelli sacrificali. Regolando attentamente le concentrazioni dei componenti iniziali, le condizioni di pH e il numero di strati, è possibile prepara…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione LRIR 16RH3003J dell’Air Force Office of Scientific Research, nonché dal programma Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) dell’Ufficio del Sottosegretario alla Difesa degli Stati Uniti per la Ricerca e l’Ingegneria.
La sequenza del vettore plasmidico per ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) è stata generosamente fornita dal Dr. J. Gallivan. I bozzoli del baco da seta di Bombyx mori sono stati generosamente donati dal Dr. D.L. Kaplan della Tufts University, MA.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
Referências
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