Preparação de Microcápsulas Multifuncionais à Base de Seda Carregadas com Plasmídeos de DNA Codificadores de RNA Aptamers e Riboswitches
Summary
O protocolo descreve a formação de microcápsulas carregadas de DNA robustas e biocompatíveis como biossensores in vitro multiplexados capazes de rastrear vários ligantes.
Abstract
Apresentamos um protocolo para a preparação de microcápsulas de fibroína de seda carregadas de DNA através do método de montagem Layer-by-Layer (LbL) em núcleos esféricos sacrificiais. Após a adsorção de uma camada prima e plasmídeos de DNA, a formação de microcápsulas robustas foi facilitada pela indução de folhas de β na estrutura secundária da seda durante a desidratação aguda de uma única camada de seda. Assim, a estratificação ocorreu via ligações múltiplas de hidrogênio e interações hidrofóbicas. Após a adsorção de cascas multicamadas, as estruturas núcleo-casca podem ser funcionalizadas com nanopartículas de ouro (AuNPs) e/ou anticorpos (IgG) para serem usadas para sensoriamento remoto e/ou entrega direcionada. O ajuste de vários parâmetros-chave durante a deposição sequencial de macromoléculas-chave em núcleos de sílica, como a presença de um primer polimérico, a concentração de DNA e proteína da seda, bem como um número de camadas adsorvidas, resultou em microcápsulas biocompatíveis, carregadas de DNA com permeabilidade variável e cargas de DNA. Após a dissolução dos núcleos de sílica, o protocolo demonstrou a formação de microcápsulas ocas e robustas com plasmídeos de DNA imobilizados na superfície interna da membrana da cápsula. A criação de uma membrana biocompatível seletivamente permeável entre os plasmídeos de DNA e o ambiente externo preservou o DNA durante o armazenamento de longo prazo e desempenhou um papel importante na resposta de saída melhorada de plasmídeos espacialmente confinados. A atividade dos modelos de DNA e sua acessibilidade foram testadas durante reações de transcrição e tradução in vitro (sistemas livres de células). Plasmídeos de DNA que codificam aptâmeros e riboswitches de RNA foram ativados com sucesso com analitos correspondentes, como foi visualizado durante a localização de transcritos de RNA marcados fluorescentemente ou proteína GFPa1 nas membranas da casca.
Introduction
O campo da biologia sintética oferece oportunidades únicas para desenvolver capacidades de sensoriamento, explorando mecanismos naturais desenvolvidos por microrganismos para monitorar seu ambiente e ameaças potenciais. É importante ressaltar que esses mecanismos de sensoriamento estão tipicamente ligados a uma resposta que protege esses microrganismos da exposição nociva, regulando a expressão gênica para mitigar efeitos negativos ou prevenir a ingestão de materiais tóxicos. Tem havido esforços significativos para projetar esses microrganismos para criar sensores de células inteiras, aproveitando essas respostas naturais, mas redirecionando-os para reconhecer novos alvos e/ou produzir um sinal mensurável que possa ser medido para fins de quantificação (tipicamente fluorescência)1,2. Atualmente, a preocupação com o uso de microrganismos geneticamente modificados (OGMs), principalmente quando liberados no ambiente ou no corpo humano, devido ao vazamento de células inteiras ou de parte de seu material genético, mesmo que encapsulado em matriz polimérica, sugere que são necessárias formas alternativas de exploração dessas abordagens desensoriamento3.
Uma abordagem poderosa para explorar os benefícios do sensoriamento baseado em microrganismos sem a preocupação com a implantação de OGMs é o uso de sistemas de transcrição/tradução in vitro (IVTT). Do ponto de vista prático, os sistemas de TIVP consistem em uma mistura contendo a maioria dos componentes celulares em estado ativo que foi “extraída” das células por diferentes meios, incluindo sonicação, batimento de contas ou outros4. O produto final deste processo é uma mistura de reação bioquímica já otimizada para realizar transcrição e tradução que pode ser usada para testar diferentes sensores em formato de “vaso aberto”, sem as restrições associadas ao uso de células inteiras (difusão de membrana, eficiência de transformação, toxicidade celular, etc.). É importante ressaltar que diferentes componentes do sensor podem ser adicionados quantitativamente, e seu efeito estudado por diferentes técnicas ópticas e espectrométricas, como demonstramos5. Tem-se notado que o desempenho dos sistemas IVTT pode ser inconsistente; No entanto, estudos recentes têm mostrado abordagens para padronizar sua preparação e caracterização, o que é de grande ajuda quando se estuda seu desempenho no projeto desensores6. Recentemente, muitos exemplos de sistemas de TICV utilizados para criar ensaios baseados em papel através da liofilização de seus componentes em matrizes de papel têm sido demonstrados, incluindo a detecção de íons de metais pesados, drogas, elementos de quorum sensing e outros 7,8,9. Um espaço de aplicação interessante para sensores baseados em IVTT é seu uso em aplicações de sensoriamento em diferentes tipos de ambientes, incluindo solo, água e corpo humano. Para implantar esses sistemas IVTT nesses ambientes desafiadores, uma abordagem de encapsulamento precisa ser implementada para conter os componentes IVTT e protegê-los da degradação.
As abordagens de encapsulação mais comuns para sistemas de TTIV incluem o uso de cápsulas lipídicas, micelas, polissomas e outros microrecipientes bem fechados10,11,12. Uma desvantagem dessa abordagem é a necessidade de incorporar mecanismos passivos ou ativos para transportar materiais dentro e fora dos contêineres para permitir a comunicação com o ambiente externo e fornecer recursos de sensoriamento. Para superar algumas dessas questões, o estudo aqui relata um método que fornece uma abordagem simples, mas eficaz, para encapsular os materiais de codificação para diferentes projetos de sensores a serem expressos em sistemas IVTT. Esta abordagem baseia-se no uso da deposição Layer-by-Layer (LbL) de um biopolímero na presença dos plasmídeos de interesse para criar microcápsulas ocas com alta porosidade, o que permite que o material genético protegido interaja com os diferentes componentes da TIDIV de escolha. O estudo demonstrou que plasmídeos encapsulados podem direcionar a transcrição e a tradução quando ativados dentro dessa matriz polimérica, como mostrado com a resposta de um aptâmero codificado por plasmídio e um riboswitch para seus alvos correspondentes. Além disso, este revestimento LbL protege os plasmídeos por meses sem quaisquer condições especiais de armazenamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microcápsulas de hidrogel seletivamente permeáveis carregadas com vários tipos de projetos de sensores codificados por DNA podem ser preparadas seguindo este protocolo. Uma das características distintivas da abordagem LbL é a capacidade de adaptar a complexidade das microcápsulas durante a montagem de baixo para cima, que geralmente começa com a adsorção de espécies moleculares em moldes de sacrifício. Ajustando cuidadosamente as concentrações dos componentes iniciais, as condições de pH e o número de cam…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela bolsa LRIR 16RH3003J do Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea, bem como pelo programa de Pesquisa Aplicada em Biologia Sintética para Ambientes Militares para o Avanço das Prioridades de C&T (ARAP) do Escritório do Subsecretário de Defesa dos EUA para Pesquisa e Engenharia.
A sequência de vetores plasmidiais para ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) foi generosamente fornecida pelo Dr. J. Gallivan. Casulos de bicho-da-seda de Bombyx mori foram generosamente doados pelo Dr. D.L. Kaplan da Tufts University, MA.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
Referências
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B., Reischl, U. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. 13, 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
