Preparación de microcápsulas multifuncionales a base de seda cargadas con plásmidos de ADN que codifican aptámeros y riboswitches de ARN
Summary
El protocolo describe la formación de microcápsulas robustas y biocompatibles cargadas de ADN como biosensores in vitro multiplexados capaces de rastrear varios ligandos.
Abstract
Introducimos un protocolo para la preparación de microcápsulas de fibroína de seda cargadas de ADN a través del método de ensamblaje capa por capa (LbL) en núcleos esféricos de sacrificio. Después de la adsorción de una capa primaria y plásmidos de ADN, la formación de microcápsulas robustas se facilitó mediante la inducción de hojas de β en la estructura secundaria de seda durante la deshidratación aguda de una sola capa de seda. Por lo tanto, la estratificación se produjo a través de múltiples enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Tras la adsorción de conchas multicapa, las estructuras núcleo-cáscara se pueden funcionalizar aún más con nanopartículas de oro (AuNP) y / o anticuerpos (IgG) para ser utilizados para la teledetección y / o la entrega dirigida. El ajuste de varios parámetros clave durante la deposición secuencial de macromoléculas clave en núcleos de sílice, como la presencia de un cebador de polímero, la concentración de ADN y proteína de seda, así como una serie de capas adsorbidas, dio como resultado microcápsulas biocompatibles y cargadas de ADN con permeabilidad variable y cargas de ADN. Tras la disolución de los núcleos de sílice, el protocolo demostró la formación de microcápsulas huecas y robustas con plásmidos de ADN inmovilizados a la superficie interna de la membrana de la cápsula. La creación de una membrana biocompatible selectivamente permeable entre los plásmidos de ADN y el entorno externo preservó el ADN durante el almacenamiento a largo plazo y desempeñó un papel importante en la respuesta de salida mejorada de plásmidos confinados espacialmente. La actividad de las plantillas de ADN y su accesibilidad se probaron durante la transcripción in vitro y las reacciones de traducción (sistemas libres de células). Los plásmidos de ADN que codifican aptámeros y riboswitches de iluminación de ARN se activaron con éxito con los analitos correspondientes, como se visualizó durante la localización de transcripciones de ARN marcadas con fluorescencia o proteína GFPa1 en las membranas de la cáscara.
Introduction
El campo de la biología sintética ofrece oportunidades únicas para desarrollar capacidades de detección mediante la explotación de mecanismos naturales evolucionados por microorganismos para monitorear su entorno y amenazas potenciales. Es importante destacar que estos mecanismos de detección suelen estar vinculados a una respuesta que protege a estos microorganismos de la exposición dañina, regulando la expresión génica para mitigar los efectos negativos o prevenir la ingesta de materiales tóxicos. Ha habido esfuerzos significativos para diseñar estos microorganismos para crear sensores de células completas aprovechando estas respuestas naturales, pero redirigiéndolas para reconocer nuevos objetivos y / o producir una señal medible que pueda medirse con fines de cuantificación (típicamente fluorescencia)1,2. Actualmente, las preocupaciones con el uso de microorganismos genéticamente modificados (OGM), especialmente cuando se liberan en el medio ambiente o en el cuerpo humano, debido a la fuga de células enteras o parte de su material genético, incluso si están encapsulados en una matriz polimérica, sugieren que se necesitan formas alternativas de explotar estos enfoques de detección3.
Un enfoque poderoso para explotar los beneficios de la detección basada en microorganismos sin la preocupación por el despliegue de OMG es el uso de sistemas de transcripción/traducción in vitro (IVTT). Desde una perspectiva práctica, los sistemas IVTT consisten en una mezcla que contiene la mayoría de los componentes celulares en un estado activo que ha sido “extraído” de las células por diferentes medios, incluyendo sonicación, bala u otros4. El producto final de este proceso es una mezcla de reacción bioquímica ya optimizada para realizar la transcripción y traducción que se puede utilizar para probar diferentes sensores en un formato de “recipiente abierto”, sin las restricciones asociadas con el uso de células enteras (difusión de membrana, eficiencia de transformación, toxicidad celular, etc.). Es importante destacar que se pueden agregar cuantitativamente diferentes componentes del sensor y estudiar su efecto mediante diferentes técnicas ópticas y espectrométricas, como hemos demostrado5. Se ha observado que el rendimiento de los sistemas IVTT puede ser inconsistente; Sin embargo, estudios recientes han mostrado enfoques para estandarizar su preparación y caracterización, lo cual es de gran ayuda al estudiar su desempeño en el diseño de sensores6. Recientemente, se han demostrado muchos ejemplos de sistemas IVTT utilizados para crear ensayos basados en papel a través de la liofilización de sus componentes en matrices de papel, incluida la detección de iones de metales pesados, medicamentos, elementos de detección de quórum y otros 7,8,9. Un espacio de aplicación emocionante para los sensores basados en IVTT es su uso en aplicaciones de detección en diferentes tipos de entornos, incluidos el suelo, el agua y el cuerpo humano. Para implementar estos sistemas IVTT en estos entornos desafiantes, se debe implementar un enfoque de encapsulación para contener los componentes IVTT y protegerlos de la degradación.
Los enfoques de encapsulación más comunes para los sistemas IVTT incluyen el uso de cápsulas lipídicas, micelas, polimerosomas y otros microcontenedores estrechamente cerrados10,11,12. Una desventaja de este enfoque es la necesidad de incorporar mecanismos pasivos o activos para transportar materiales dentro y fuera de los contenedores para permitir la comunicación con el entorno externo y proporcionar capacidades de detección. Para superar algunos de estos problemas, el estudio aquí informa un método que proporciona un enfoque simple pero efectivo para encapsular los materiales de codificación para diferentes diseños de sensores que se expresarán en sistemas IVTT. Este enfoque se basa en el uso de la deposición capa por capa (LbL) de un biopolímero en presencia de los plásmidos de interés para crear microcápsulas huecas con alta porosidad, lo que permite que el material genético protegido interactúe con los diferentes componentes del IVTT de elección. El estudio demostró que los plásmidos encapsulados podían dirigir la transcripción y la traducción cuando se activan dentro de esta matriz polimérica, como se muestra con la respuesta de un aptámero codificado por plásmidos y un riboswitch a sus objetivos correspondientes. Además, este recubrimiento LbL protege los plásmidos durante meses sin condiciones especiales de almacenamiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las microcápsulas de hidrogel selectivamente permeables cargadas con varios tipos de diseños de sensores codificados por ADN se pueden preparar siguiendo este protocolo. Una de las características distintivas del enfoque LbL es la capacidad de adaptar la complejidad de las microcápsulas durante el ensamblaje ascendente, que generalmente comienza con la adsorción de especies moleculares en plantillas de sacrificio. Ajustando cuidadosamente las concentraciones de los componentes iniciales, las condiciones de pH y el n…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención LRIR 16RH3003J de la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea, así como el programa de Investigación Aplicada de Biología Sintética para Entornos Militares para el Avance de las Prioridades de Ciencia y Tecnología (ARAP) de la Oficina del Subsecretario de Defensa de los Estados Unidos para Investigación e Ingeniería.
La secuencia vectorial plásmida para ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) fue generosamente proporcionada por el Dr. J. Gallivan. Los capullos de gusanos de seda de Bombyx mori fueron generosamente donados por el Dr. DL Kaplan de la Universidad de Tufts, MA.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
Referências
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B., Reischl, U. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. 13, 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
