무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지
Summary
이 연구는 에스케리치아 콜라이 (E. coli )에서 세포 추출물을 제조한 후 24 시간 이내에 무세포 단백질 합성 (CFPS) 반응을 설명합니다. 무세포 자동 유도 (CFAI) 프로토콜에 대한 설명은 연구자의 감독을 줄이고 얻은 세포 추출물의 양을 늘리기 위해 개선 된 내용을 자세히 설명합니다.
Abstract
무세포 단백질 합성(CFPS)은 시험관 내에서 전사 및 번역 기계를 포획하는 생명공학 플랫폼으로 성장했습니다. 수많은 개발로 인해 CFPS 플랫폼은 새로운 사용자가 더 쉽게 액세스 할 수있게되었으며 응용 프로그램의 범위를 확장했습니다. 용해물 기반 CFPS 시스템의 경우, 세포 추출물은 다양한 유기체로부터 생성될 수 있으며, 단백질 합성을 증강시키기 위해 숙주의 독특한 생화학을 이용한다. 지난 20 년 동안 대장균 (E. coli) 은 경제성과 다양성으로 인해 CFPS를 지원하는 데 가장 널리 사용되는 유기체 중 하나가되었습니다. 수많은 주요 발전에도 불구하고, 대장균 세포 추출물 제조를 위한 워크플로우는 신규 사용자가 자신의 애플리케이션에 CFPS를 구현하는 데 있어 중요한 병목 현상으로 남아 있습니다. 추출물 준비 작업 과정은 시간이 많이 걸리며 재현 가능한 결과를 얻기 위해 기술적 전문 지식이 필요합니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 우리는 이전에 사용자 입력 및 필요한 기술 전문 지식을 줄이는 24 시간 무세포 자동 유도 (CFAI) 워크 플로의 개발을보고했습니다. CFAI 워크플로우는 세포 추출물을 생성하는 데 필요한 노동력과 기술 기술을 최소화하는 동시에 획득한 세포 추출물의 총 양을 증가시킵니다. 여기에서는 접근성을 향상시키고 대장균 기반 CFPS의 광범위한 구현을 지원하기 위해 단계별로 워크 플로우를 설명합니다.
Introduction
생명 공학 응용 분야를위한 무세포 단백질 합성 (CFPS)의 사용은 지난 몇 년 동안 1,2,3 년 동안 크게 증가했습니다. 이러한 개발은 부분적으로 CFPS에서 발생하는 프로세스와 각 구성 요소 4,5의 역할을 이해하려는 노력이 증가했기 때문일 수 있습니다. 또한 최적화 된 설정 및 대체 에너지 원으로 인한 비용 절감으로 인해 새로운 사용자 6,7,8,9를 위해 무세포 기술을 쉽게 구현할 수있었습니다. 단백질 합성에 필요한 전사 및 번역 인자를 구현하기 위해, 세포 추출물은 종종 무세포 반응(10)을 구동하는데 사용된다. 최근 출판 된 사용자 가이드는 기능 추출을 생성하기위한 간단한 프로토콜을 제공하여 신규 및 숙련 된 사용자 모두에게 구현하기가 더 쉬워졌습니다1,11,12,13,14. 세포 추출물은 일반적으로 세포 배양물의 용해를 통해 얻어지며, 이는 원하는 특정 용도1,15,16에 따라 다른 유기체를 사용하여 성장할 수 있다.
대장균(E. coli)은 기능성 추출물(17)을 생산하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 숙주 유기체 중 하나가 되었다. 상기 BL21 스타(DE3) 균주는 외막으로부터 프로테아제(OmpT 프로테아제) 및 세포질(Lon protease)을 제거하여, 재조합 단백질 발현을 위한 최적의 환경을 제공하기 때문에 바람직하다. 추가적으로, DE3은 lacUV5 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 폴리머라제 (T7 RNAP)에 대한 유전자를 운반하는 λDE3을 함유하고; 스타 성분은 mRNA4,14,18,19의 절단을 방지하는 돌연변이된 RNaseE 유전자를 함유한다. lacUV5 프로모터 하에서, 이소프로필티오갈락토피라노시드 (IPTG) 유도는 T7 RNAP20,21의 발현을 허용한다. 이 균주는 세포를 재배하고 수확하는 데 사용되며, 이는 추출물 준비를위한 원료를 제공합니다. 세포 용해는 비드 박동, 프렌치 프레스, 균질화, 초음파 처리 및 질소 캐비테이션1,11,12,22를 포함한 다양한 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다.
박테리아 배양 및 수확 과정은 대장균을 사용할 때 대부분의 플랫폼에서 일관되지만 며칠이 걸리고 강렬한 연구자 감독1,11,13이 필요합니다. 이 과정은 일반적으로 LB 국물에서 하룻밤 종자 배양으로 시작되며, 이는 밤새 성장시 다음날 2xYTPG (효모, 트립톤, 인산염 완충액, 포도당)의 더 큰 배양물에 접종된다. 이러한 더 큰 배양물의 성장은 2.514,20의 광학 밀도 (OD)에서 초기 내지 중간 로그 단계에 도달할 때까지 모니터링된다. 전사 및 번역의 구성 요소가 이전에 초기 내지 중간 로그 단계23,24에서 고도로 활성인 것으로 입증되었기 때문에 지속적인 측정이 요구된다. 이 과정이 재현 가능한 추출물을 만들 수 있지만, 우리 연구실은 최근 연구원의 감독을 줄이고 주어진 1 리터의 세포 배양에 대한 추출물의 전반적인 수율을 높이며 숙련 된 사용자와 신규 사용자 모두를위한 대장균 기반 추출물 제제에 대한 액세스를 향상시키는 무세포 자동 유도 (CFAI) Media를 사용하는 새로운 방법을 개발했습니다 (그림 1 ). 여기서 우리는 CFAI 워크플로우를 구현하기 위한 단계별 가이드를 제공하며, 줄무늬가 있는 세포 플레이트에서 24시간 이내에 완료된 CFPS 반응으로 이동합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
연구원의 감독은 전통적으로 세포 성장 동안 두 가지 주요 작용, 즉 T7 RNAP의 유도와 특정OD600에서 세포를 수확하는 데 필요합니다. CFAI는 고품질의 세포 추출물을 제조하기 위해 필요한 연구자의 시간과 기술 교육을 줄이기 위해 이러한 요구 사항을 모두 제거합니다. T7 RNAP의 자동 유도는 배지 내의 일차 당으로서 글루코스를 락토오스로 대체함으로써, 세포 성장 동안 정확한 지점에서 IPTG?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Jennifer VanderKelen 박사와 Andrea Laubscher가 기술 지원을 받고 있음을 인정하고 싶습니다. 저자는 또한 니콜 그레고리오, 맥스 레빈, 알리사 멀린, 병철 소, 어거스트 브룩웰, 엘리자베스 (리지) 보이보다, 로건 버링턴, 질리언 카스만에게 도움이 된 토론에 감사드립니다. 저자는 또한 빌 앤 린다 프로스트 펀드, 생명 공학의 셰브론 생명 공학 응용 연구 기부 보조금 센터, 칼 폴리 연구, 학술 및 국립 과학 재단 (NSF-1708919)의 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
Referências
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