Identification globale des réseaux d’interaction co-translationnelle par profilage sélectif des ribosomes

Summary

Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications de la chaîne naissante, le ciblage, le pliage et les voies d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Ces dernières années, il est devenu évident que les ribosomes non seulement décodent notre ARNm, mais guident également l’émergence de la chaîne polypeptidique dans l’environnement cellulaire encombré. Les ribosomes fournissent la plate-forme pour la liaison contrôlée spatialement et cinétiquement des facteurs de ciblage membranaire, modifiant les enzymes et pliant les chaperons. Même l’assemblage en complexes oligomères d’ordre élevé, ainsi que les étapes de formation du réseau protéine-protéine, ont récemment été découverts pour être coordonnés avec la synthèse.

Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode développée pour capturer les interactions co-translationnelles in vivo. Nous détaillerons les différentes étapes de purification d’affinité requises pour capturer les complexes de chaîne naissante de ribosomes avec des interacteurs co-traductionnels, ainsi que les étapes d’extraction de l’ARNm, d’exclusion de taille, de transcription inverse, de séquençage en profondeur et d’analyse de données volumineuses, nécessaires pour déchiffrer les interactions co-traductionnelles en résolution proche du codon.

Introduction

Lerofilage de l’ibosome RR (SeRP) est la seule méthode, à ce jour, qui capture et caractérise les interactions co-translationnelles, in vivo, de manière directe ^1,2,3,4,5,6. SeRP permet un profilage global des interactions de n’importe quel facteur avec la traduction des ribosomes en résolution proche du codon ^2,7.

La méthode repose sur la congélation éclair des cellules en croissance et la préservation de la traduction active. Les lysats cellulaires sont ensuite traités avec de la RNase I pour digérer tout l’ARNm dans la cellule, à l’exception des fragments d’ARNm protégés par les ribosomes appelés « empreintes de ribosomes ». L’échantillon est ensuite divisé en deux parties; une partie est directement utilisée pour l’isolement de toutes les empreintes ribosomiques cellulaires, représentant toute la traduction en cours dans la cellule. La deuxième partie est utilisée pour la purification d’affinité du sous-ensemble spécifique de ribosomes associés à un facteur d’intérêt, par exemple: enzymes modificatrices, facteurs de translocation, chaperons de repliement et interactions d’assemblage complexe. Les empreintes ribosomiques purifiées par affinité sont collectivement appelées interactome. Ensuite, les ARNm protégés par les ribosomes sont extraits et utilisés pour la génération de bibliothèque d’ADNc, suivie d’un séquençage en profondeur.

L’analyse comparative des échantillons totaux de translatome et d’interactome permet d’identifier tous les orfs associés au facteur d’intérêt, ainsi que la caractérisation de chaque profil d’interaction orf. Ce profil rapporte les séquences précises d’apparition et de terminaison de l’engagement à partir desquelles on peut déduire les codons décodés et les résidus respectifs de la chaîne polypeptidique émergente, ainsi que sur les variations de vitesse des ribosomes au cours de ^{l’interaction 7,8}. La figure 1 illustre le protocole sous forme de schéma.

Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole SeRP. Ce protocole peut être effectué dans son intégralité dans un délai de 7 à 10 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. Génération de souches pour le profilage sélectif des ribosomes NOTE: Lerofiling Ribosome P(SeRP) est une méthode qui repose sur la purification d’affinité des facteurs d’intérêt, pour évaluer leur mode d’interaction avec les complexes de chaînes naissantes de ribosomes. La recombinaison homologue9, ainsi que les méthodes basées sur CRISPR/Cas910 sont utilisées pour fusionner divers facteurs d’intérêt av…

Representative Results

Comme l’illustre l’organigramme de ce protocole (Figure 1), les cellules ont été cultivées en phase logarithmique, puis collectées rapidement par filtration et lysées par broyage cryogénique. Le lysat a ensuite été divisé en deux: l’un pour les empreintes totales d’ARNm protégées par les ribosomes et l’autre pour les empreintes d’ARNm protégées par les ribosomes sélectionnées, sur lesquelles nous avons effectué une purification d’affinité pour abaisser les comp…

Discussion

Ici, le protocole détaille l’approche de profilage sélectif des ribosomes pour capturer les interactions co-traductionnelles dans une résolution proche du codon. Au fur et à mesure que le ribosome devient une plaque tournante pour coordonner l’émergence de la chaîne naissante dans le cytoplasme surpeuplé, il s’agit d’une méthode cruciale pour identifier et caractériser les diverses interactions co-translationnelles nécessaires pour assurer un protéome fonctionnel, ainsi que pour étudier diverses mala…

Materials

3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide	IDT	custom order	RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol	VWR	20821
Acid phenol–chloroform	Ambion	AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto agar	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto tryptone	BD	211699
Bacto yeast extract	BD	212720
Bestatin hydrochloride	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligase*	Epicentre	CL9025K	100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution	Roth	4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC treated and sterile filtered water*	Sigma	95284
D-Glucose anhydrous	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsulfoxide*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA loading dye*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I, recombinant	Roche	4716728001	RNAse free
dNTP solution set*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glycerol	VWR	24388.260.
Glycine solution	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion polymerase*	NEB	M0530L
HK from S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Hydrochloric acid	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Roth	CN08
Kanamycin	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	custom order
Liquid nitrogen
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4·2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4·H2O	Roth	K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 substitute	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride	Roth	6367
Precast gels	Bio-Rad	5671034	10% and 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase free
Sodium acetate*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5.5
Sodium azide	Merck	S8032-100G
Sodium chloride	Roth	9265
Sodium hydroxide*	Sigma	S2770	1 N
Sucrose	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 polynucleotide kinase*	NEB	M0201L
T4 RNA ligase 2*	NEB	M0242L
TBE polyacrylamide gel*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE–urea sample buffer*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer*	Invitrogen	15581-044
* – for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm,	Millipore	XX1009020
ground joint flask 1 L ,	Millipore	XX1504705