चयनात्मक राइबोसोम प्रोफाइलिंग द्वारा सह-अनुवादक इंटरैक्शन नेटवर्क की वैश्विक पहचान
Summary
सह-अनुवादक इंटरैक्शन नवजात-श्रृंखला संशोधनों, लक्ष्यीकरण, तह और असेंबली मार्गों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहां, हम चयनात्मक राइबोसोम प्रोफाइलिंग का वर्णन करते हैं, विवो में एक विधि, मॉडल यूकेरियोट सैकेरोमाइसेस सेरेविसिया में इन इंटरैक्शन का प्रत्यक्ष विश्लेषण।
Abstract
हाल के वर्षों में, यह स्पष्ट हो गया है कि राइबोसोम न केवल हमारे एमआरएनए को डिकोड करते हैं, बल्कि भीड़ वाले सेलुलर वातावरण में पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के उद्भव का मार्गदर्शन भी करते हैं। राइबोसोम झिल्ली-लक्ष्यीकरण कारकों के स्थानिक और किनेटिक रूप से नियंत्रित बंधन, एंजाइमों को संशोधित करने और चैपरोन को तह करने के लिए मंच प्रदान करते हैं। यहां तक कि उच्च-क्रम ओलिगोमेरिक परिसरों में असेंबली, साथ ही प्रोटीन-प्रोटीन नेटवर्क गठन चरणों को हाल ही में संश्लेषण के साथ समन्वित करने की खोज की गई थी।
यहां, हम चयनात्मक राइबोसोम प्रोफाइलिंग का वर्णन करते हैं, विवो में सह-अनुवादक इंटरैक्शन को पकड़ने के लिए विकसित एक विधि। हम राइबोसोम-नवजात-श्रृंखला परिसरों को सह-अनुवादक इंटरैक्टर्स के साथ-साथ एमआरएनए निष्कर्षण, आकार बहिष्करण, रिवर्स प्रतिलेखन, गहरी अनुक्रमण और बड़े डेटा विश्लेषण चरणों के साथ कैप्चर करने के लिए आवश्यक विभिन्न आत्मीयता शुद्धिकरण चरणों का विस्तार करेंगे, जो निकट-कोडन रिज़ॉल्यूशन में सह-अनुवादक इंटरैक्शन को समझने के लिए आवश्यक हैं।
Introduction
एसईलेक्टिव आरइबोसोम पीरोफिलिंग (एसईआरपी) आज तक का एकमात्र तरीका है, जो विवो में, सीधे तरीके से 1,2,3,4,5,6 में सह-अनुवादक इंटरैक्शन को कैप्चर और चिह्नित करता है। एसईआरपी निकट कोडन रिज़ॉल्यूशन 2,7 में राइबोसोम का अनुवाद करने के साथ किसी भी कारक की बातचीत की वैश्विक रूपरेखा को सक्षम बनाता है।
विधि बढ़ती कोशिकाओं के फ्लैश फ्रीजिंग और सक्रिय अनुवाद को संरक्षित करने पर निर्भर करती है। राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए टुकड़ों को छोड़कर सेल में सभी एमआरएनए को पचाने के लिए सेल लाइसेट्स को आरनेस आई के साथ इलाज किया जाता है जिसे “राइबोसोम पैरों के निशान” कहा जाता है। नमूना तब दो भागों में विभाजित किया जाता है; एक भाग का उपयोग सीधे सभी सेलुलर राइबोसोमल पैरों के निशान के अलगाव के लिए किया जाता है, जो सेल में सभी चल रहे अनुवाद का प्रतिनिधित्व करता है। दूसरे भाग का उपयोग ब्याज के कारक से जुड़े राइबोसोम के विशिष्ट सबसेट की आत्मीयता-शुद्धि के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए: एंजाइमों को संशोधित करना, अनुवाद कारक, तह चैपरोन और जटिल-असेंबली इंटरैक्शन। आत्मीयता-शुद्ध राइबोसोमल पैरों के निशान को सामूहिक रूप से इंटरैक्टोम कहा जाता है। फिर, राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए निकाले जाते हैं और सीडीएनए लाइब्रेरी पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाते हैं, इसके बाद गहरी अनुक्रमण होता है।
कुल अनुवाद और इंटरैक्टोम नमूनों का तुलनात्मक विश्लेषण उन सभी ऑर्फ की पहचान करने की अनुमति देता है जो ब्याज के कारक के साथ-साथ प्रत्येक ओआरएफ इंटरैक्शन प्रोफाइल के लक्षण वर्णन के साथ जुड़ते हैं। यह प्रोफ़ाइल सटीक सगाई की शुरुआत और समाप्ति अनुक्रमों की रिपोर्ट करती है जिसमें से कोई डीकोडेड कोडन और उभरती पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के संबंधित अवशेषों के साथ-साथ बातचीत 7,8 के दौरान राइबोसोम गति भिन्नताओं का अनुमान लगा सकता है। चित्रा 1 एक योजनाबद्ध के रूप में प्रोटोकॉल को दर्शाता है।
चित्रा 1: एसईआरपी प्रोटोकॉल का अवलोकन। यह प्रोटोकॉल 7-10 दिनों के भीतर अपनी संपूर्णता में किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, प्रोटोकॉल निकट कोडन रिज़ॉल्यूशन में सह-अनुवादक इंटरैक्शन को कैप्चर करने के लिए चयनात्मक राइबोसोम प्रोफाइलिंग दृष्टिकोण का विवरण देता है। चूंकि राइबोसोम भीड़ वाले साइटोप्लाज्म में नवजात-श्रृ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को उपयोगी चर्चा के लिए और मुहम्मद मखज़ुमी को पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम आईएसएफ (इजरायल साइंस फाउंडेशन) अनुदान 2106/20 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide | IDT | custom order | RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3' |
| Absolute ethanol | VWR | 20821 | |
| Acid phenol–chloroform | Ambion | AM9722 | |
| Antibody: mouse monclonal anti-HA | Merck | 11583816001 | 12CA5 |
| Aprotinin | Roth | A162.3 | |
| ATP* | NEB | P0756S | 10 mM |
| Bacto agar | BD | 214030 | |
| Bacto peptone | BD | 211820 | |
| Bacto tryptone | BD | 211699 | |
| Bacto yeast extract | BD | 212720 | |
| Bestatin hydrochloride | Roth | 2937.2 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| CircLigase II ssDNA Ligase* | Epicentre | CL9025K | 100 U/μL |
| Colloidal Coomassie staining solution | Roth | 4829 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 29384100 | |
| Cycloheximide | Biological Industries | A0879 | |
| DEPC treated and sterile filtered water* | Sigma | 95284 | |
| D-Glucose anhydrous | Merck | G5767-500G | |
| Diethylpyrocarbonate | Roth | K028 | |
| Dimethylsulfoxide* | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* | Thermo Fisher Scientific | SM1313 | |
| DNA loading dye* | Thermo Fisher Scientific | R0631 | 6× |
| DNase I, recombinant | Roche | 4716728001 | RNAse free |
| dNTP solution set* | NEB | N0446S | |
| EDTA* | Roth | 8043 | |
| Glycerol | VWR | 24388.260. | |
| Glycine solution | Sigma-Aldrich | 67419-1ML-F | 1 M |
| GlycoBlue | Ambion | AM9516 | 15 mg/mL |
| HEPES | Roth | HN78.3 | |
| HF Phusion polymerase* | NEB | M0530L | |
| HK from S. cerevisiae | Sigma-Aldrich | H6380-1.5KU | |
| Hydrochloric acid | AppliChem | A1305 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 33539 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Roth | CN08 | |
| Kanamycin | Roth | T832.4 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| Leupeptin | Roth | CN33.4 | |
| Linker L(rt) | IDT | custom order | |
| Liquid nitrogen | |||
| MgCl2 | Roth | KK36.3 | |
| Na2HPO4 | Roth | P030.2 | |
| Na2HPO4·2H2O | Roth | T879.3 | |
| NaCl* | Invitrogen | AM97606 | 5 M |
| NaH2PO4·H2O | Roth | K300.2 | |
| NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads | GE Life Sciences | 17090601 | |
| Nonidet P 40 substitute | Sigma | 74385 | |
| Pepstatin A | Roth | 2936.2 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride | Roth | 6367 | |
| Precast gels | Bio-Rad | 5671034 | 10% and 12% |
| RNase I | Ambion | AM2294 | |
| SDS, 20% | Ambion | AM9820 | RNase free |
| Sodium acetate* | Ambion | AM9740 | 3 M, pH 5.5 |
| Sodium azide | Merck | S8032-100G | |
| Sodium chloride | Roth | 9265 | |
| Sodium hydroxide* | Sigma | S2770 | 1 N |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
| Superscript III Reverse Transciptase* | Invitrogen | 18080-044 | |
| SYBR Gold* | Invitrogen | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase* | NEB | M0201L | |
| T4 RNA ligase 2* | NEB | M0242L | |
| TBE polyacrylamide gel* | Novex | EC6215BOX | 8% |
| TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC68752BOX | 10% |
| TBE–urea polyacrylamide gel* | Novex | EC6885BOX | 15% |
| TBE–urea sample buffer* | Novex | LC6876 | 2× |
| Tris | Roth | 4855 | |
| Tris* | Ambion | AM9851 | 1 M, pH 7.0 |
| Tris* | Ambion | AM9856 | 1 M, pH 8.0 |
| UltraPure 10× TBE buffer* | Invitrogen | 15581-044 | |
| * – for library preparation | |||
| gasket and spring clamp , 90 mm, | Millipore | XX1009020 | |
| ground joint flask 1 L , | Millipore | XX1504705 |
Referências
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