Summary

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

Published: October 07, 2021
doi:

Summary

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

Abstract

최근 몇 년 동안, 리보솜은 우리의 mRNA를 해독 할뿐만 아니라 혼잡 한 세포 환경으로 폴리펩티드 사슬의 출현을 안내한다는 것이 분명 해졌다. 리보솜은 막 표적화 인자의 공간적 및 동역학적으로 조절된 결합, 효소 변형 및 접이식 샤페론을 위한 플랫폼을 제공한다. 심지어 고차 올리고머 복합체로의 조립뿐만 아니라 단백질-단백질 네트워크 형성 단계도 합성과 배위되는 것으로 최근에 발견되었다.

여기에서는 생체 내에서 공동 번역 상호 작용을 캡처하기 위해 개발 된 방법 인 선택적 리보솜 프로파일 링 에 대해 설명합니다. 우리는 공동 번역 상호 작용기와 함께 리보솜 – 초기 사슬 복합체를 캡처하는 데 필요한 다양한 친화성 정제 단계뿐만 아니라 mRNA 추출, 크기 배제, 역전사, 딥 시퀀싱 및 빅 데이터 분석 단계를 자세히 설명합니다 거의 코돈 분해능에서 공동 번역 상호 작용을 해독하는 데 필요합니다.

Introduction

Se lective Ribosome Profiling (SeRP)은 현재까지 1,2,3,4,5,6 직접적인 방식으로 생체 내에서 공동 번역 상호 작용을 캡처하고 특성화하는 유일한 방법입니다. SeRP는 코돈 분해능 2,7에 가까운 리보솜을 번역하는 모든 인자의 상호작용에 대한 글로벌 프로파일링을 가능하게 한다.

이 방법은 성장하는 세포의 플래시 동결과 활성 번역 보존에 의존합니다. 이어서, 세포 용해물은 RNase I로 처리되어 “리보솜 발자국”으로 불리는 리보솜-보호된 mRNA 단편을 제외한 세포 내의 모든 mRNA를 소화시킨다. 그런 다음 샘플을 두 부분으로 나눕니다. 한 부분은 모든 세포 리보솜 발자국의 분리에 직접 사용되며, 이는 세포에서 진행중인 모든 번역을 나타냅니다. 두 번째 부분은 관심 인자와 관련된 리보솜의 특정 서브세트의 친화도-정제를 위해 사용된다: 예를 들어: 변형 효소, 전좌 인자, 폴딩 샤페론, 및 복합체-어셈블리 상호작용. 친화도 정제된 리보솜 발자국은 집합적으로 인터랙텀(interactome)이라고 불린다. 이어서, 리보솜-보호된 mRNA를 추출하고 cDNA 라이브러리 생성에 사용하고, 이어서 딥 시퀀싱을 수행한다.

전체 트랜스라톰 및 인터랙토메 샘플의 비교 분석은 관심 인자와 관련된 모든 orfs의 동정뿐만 아니라 각 orf 상호작용 프로파일의 특성화를 허용한다. 이 프로파일은 정확한 결합 개시 및 종결 서열을 보고하며, 이로부터 해독된 코돈 및 신흥 폴리펩티드 쇄의 각각의 잔기를 추론할 수 있을 뿐만 아니라, 상호작용 동안 리보솜 속도 변이(7,8)에 대해서도 보고한다. 그림 1은 프로토콜을 회로도로 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: SeRP 프로토콜의 개요 이 프로토콜은 7-10 일 이내에 전체적으로 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

1. 선택적 리보솜 프로파일링을 위한 균주 생성 참고: Selective Ribosome Profiling (SeRP)은 리보솜-초기 사슬 복합체와의 상호작용 모드를 평가하기 위해 관심 인자의 친화성 정제에 의존하는 방법이다. 상동성 재조합(9) 및 CRISPR/Cas910 기반 방법은 친화성 정제를 위해 다양한 관심 인자를 태그와 융합시키기 위해 이용된다. 이러한 태?…

Representative Results

이 프로토콜의 흐름도(도 1)에 예시된 바와 같이, 세포를 로그 페이즈로 성장시킨 다음, 여과에 의해 신속하게 수집하고, 극저온 분쇄에 의해 용해시켰다. 그런 다음 용해물을 두 개로 나눴습니다: 하나는 총 리보솜-보호된 mRNA 풋프린트에 대한 것이고 다른 하나는 선택된 리보솜-보호된 mRNA 풋프린트에 대한 것이고, 우리는 태그된 단백질-리보솜-초기 사슬 복합체를 풀다운하…

Discussion

여기서, 프로토콜은 코돈 분해능에 가까운 공동-번역 상호작용을 캡처하기 위한 선택적 리보솜 프로파일링 접근법을 상세히 설명한다. 리보솜이 붐비는 세포질로 출현하는 초기 사슬을 조정하기위한 허브로 상승함에 따라, 이것은 기능적 프로테옴을 보장하고 다양한 질병을 연구하는 데 필요한 다양한 공동 번역 상호 작용을 확인하고 특성화하는 중요한 방법입니다. 현재까지, SeRP는 생체내<…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 유익한 토론을 해준 모든 실험실 구성원들과 원고의 비판적 독서에 대한 무하마드 Makhzumy에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 ISF (이스라엘 과학 재단) 보조금 2106/20에 의해 지원되었습니다.

Materials

3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide IDT custom order RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol VWR 20821
Acid phenol–chloroform Ambion AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA Merck 11583816001 12CA5
Aprotinin Roth A162.3
ATP* NEB P0756S 10 mM
Bacto agar BD 214030
Bacto peptone BD 211820
Bacto tryptone BD 211699
Bacto yeast extract BD 212720
Bestatin hydrochloride Roth 2937.2
Chloroform Merck 102445
CircLigase II ssDNA Ligase* Epicentre CL9025K 100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution Roth 4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 29384100
Cycloheximide Biological Industries A0879
DEPC treated and sterile filtered water* Sigma 95284
D-Glucose anhydrous Merck G5767-500G
Diethylpyrocarbonate Roth K028
Dimethylsulfoxide* Sigma-Aldrich 276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* Thermo Fisher Scientific SM1313
DNA loading dye* Thermo Fisher Scientific R0631
DNase I, recombinant Roche 4716728001 RNAse free
dNTP solution set* NEB N0446S
EDTA* Roth 8043
Glycerol VWR 24388.260.
Glycine solution Sigma-Aldrich 67419-1ML-F 1 M
GlycoBlue Ambion AM9516 15 mg/mL
HEPES Roth HN78.3
HF Phusion polymerase* NEB M0530L
HK from S. cerevisiae Sigma-Aldrich H6380-1.5KU
Hydrochloric acid AppliChem A1305
Isopropanol Sigma-Aldrich 33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Roth CN08
Kanamycin Roth T832.4
KCl Roth 6781.1
KH2PO4 Roth 3904.1
Leupeptin Roth CN33.4
Linker L(rt) IDT custom order
Liquid nitrogen
MgCl2 Roth KK36.3
Na2HPO4 Roth P030.2
Na2HPO4·2H2O Roth T879.3
NaCl* Invitrogen AM97606 5 M
NaH2PO4·H2O Roth K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads GE Life Sciences 17090601
Nonidet P 40 substitute Sigma 74385
Pepstatin A Roth 2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride Roth 6367
Precast gels Bio-Rad 5671034 10% and 12%
RNase I Ambion AM2294
SDS, 20% Ambion AM9820 RNase free
Sodium acetate* Ambion AM9740 3 M, pH 5.5
Sodium azide Merck S8032-100G
Sodium chloride Roth 9265
Sodium hydroxide* Sigma S2770 1 N
Sucrose Sigma-Aldrich 16104
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Superscript III Reverse Transciptase* Invitrogen 18080-044
SYBR Gold* Invitrogen S11494
T4 polynucleotide kinase* NEB M0201L
T4 RNA ligase 2* NEB M0242L
TBE polyacrylamide gel* Novex EC6215BOX 8%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC68752BOX 10%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC6885BOX 15%
TBE–urea sample buffer* Novex LC6876
Tris Roth 4855
Tris* Ambion AM9851 1 M, pH 7.0
Tris* Ambion AM9856 1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer* Invitrogen 15581-044
* – for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm, Millipore  XX1009020
ground joint flask 1 L , Millipore XX1504705

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Citar este artigo
Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, A. Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (176), e62878, doi:10.3791/62878 (2021).

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