Identificação Global de Redes de Interação Co-Translacional por Perfil Seletivo Ribosome

Summary

As interações co-translacionais desempenham um papel crucial nas modificações da cadeia nascente, na segmentação, na dobra e nas vias de montagem. Aqui, descrevemos o Perfil Ribossomo Seletivo, um método para in vivo, análise direta dessas interações no modelo eucariote Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Nos últimos anos, tornou-se evidente que ribossomos não só decodificam nosso mRNA, mas também guiam o surgimento da cadeia de polipeptídeos no ambiente celular lotado. Os ribossomos fornecem a plataforma para a ligação espacial e cineticamente controlada de fatores de segmentação de membrana, modificando enzimas e acompanhantes dobráveis. Até mesmo a montagem em complexos oligomericos de alta ordem, bem como etapas de formação de rede proteína-proteína, foram recentemente descobertas como coordenadas com síntese.

Aqui, descrevemos o Selective Ribosome Profiling, um método desenvolvido para capturar interações co-translacionais in vivo. Detalharemos as várias etapas de purificação de afinidade necessárias para capturar complexos ribossomo-nascentes, juntamente com os interlaciadores co-translacionais, bem como a extração de mRNA, exclusão de tamanho, transcrição reversa, sequenciamento profundo e etapas de análise de big data, necessárias para decifrar interações co-translacionais em resolução de quase codon.

Introduction

Selective Ribosome Profiling (SeRP) é o único método, até o momento, que captura e caracteriza interações co-translacionais, in vivo, de forma direta ^1,2,3,4,5,6. O SeRP permite o perfil global de interações de qualquer fator com a tradução de ribossomos na resolução ^2,7 de códon próximo.

O método se baseia no congelamento flash de células em crescimento e na preservação da tradução ativa. Os lises celulares são então tratados com RNase I para digerir todo o mRNA na célula, exceto fragmentos de mRNA protegidos por ribossomos denominados “pegadas ribossósas”. A amostra é então dividida em duas partes; uma parte é diretamente usada para o isolamento de todas as pegadas ribossômicas celulares, representando toda a tradução contínua na célula. A segunda parte é utilizada para a afinidade-purificação do subconjunto específico de ribossomos associados a um fator de interesse, por exemplo: modificação de enzimas, fatores de translocação, acompanhantes dobráveis e interações de montagem complexa. As pegadas ribossômicas purificadas por afinidade são coletivamente chamadas de interactome. Em seguida, os mRNAs protegidos por ribossomo são extraídos e usados para a geração de biblioteca cDNA, seguido de sequenciamento profundo.

A análise comparativa das amostras totais de translatome e interactome permite a identificação de todos os orfs que associam ao fator de interesse, bem como a caracterização de cada perfil de interação orf. Este perfil relata as sequências precisas de início e término de engajamento a partir das quais se pode inferir os códons decodificados e os respectivos resíduos da cadeia emergente de polipeptídeos, bem como sobre as variações de velocidade ribossosome durante a interação ^7,8. A Figura 1 retrata o protocolo como um esquema.

Figura 1: Uma visão geral do protocolo SeRP. Este protocolo pode ser realizado em sua totalidade dentro de 7-10 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Gerando cepas para o perfil seletivo ribossomo NOTA: Selective Ribosome Profiling (SeRP) é um método que se baseia na purificação de afinidade de fatores de interesse, para avaliar seu modo de interação com complexos de cadeia ribossomos-nascentes. A recombinação homologiosa9, bem como métodos baseados em CRISPR/Cas910 são utilizados para fundir vários fatores de interesse com etiquetas para purificações de afin…

Representative Results

Conforme ilustrado no fluxograma deste protocolo (Figura 1), as células foram cultivadas para a fase de registro, e depois coletadas rapidamente pela filtragem e líricas pela moagem criogênica. O lysate foi então dividido em dois: um para pegadas totais de mRNA protegidos por ribossomo e outro para pegadas de mRNA protegidas por ribossomo selecionados, nas quais realizamos purificação de afinidade para puxar para baixo os complexos de cadeias de proteína-ribossomo-nascentes marcadas. …

Discussion

Aqui, o protocolo detalha a abordagem de Perfil Ribossomo Seletivo para capturar interações co-translacionais em resolução de códon próximo. À medida que o ribossomo surge como um centro para coordenar o surgimento da cadeia nascente no citoplasma lotado, este é um método crucial para identificar e caracterizar as diversas interações co-translacionais necessárias para garantir um proteome funcional, bem como para o estudo de várias doenças. Até o momento, o SeRP é o único método que pode capturar e car…

Materials

3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide	IDT	custom order	RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol	VWR	20821
Acid phenol–chloroform	Ambion	AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto agar	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto tryptone	BD	211699
Bacto yeast extract	BD	212720
Bestatin hydrochloride	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligase*	Epicentre	CL9025K	100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution	Roth	4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC treated and sterile filtered water*	Sigma	95284
D-Glucose anhydrous	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsulfoxide*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA loading dye*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I, recombinant	Roche	4716728001	RNAse free
dNTP solution set*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glycerol	VWR	24388.260.
Glycine solution	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion polymerase*	NEB	M0530L
HK from S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Hydrochloric acid	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Roth	CN08
Kanamycin	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	custom order
Liquid nitrogen
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4·2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4·H2O	Roth	K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 substitute	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride	Roth	6367
Precast gels	Bio-Rad	5671034	10% and 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase free
Sodium acetate*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5.5
Sodium azide	Merck	S8032-100G
Sodium chloride	Roth	9265
Sodium hydroxide*	Sigma	S2770	1 N
Sucrose	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 polynucleotide kinase*	NEB	M0201L
T4 RNA ligase 2*	NEB	M0242L
TBE polyacrylamide gel*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE–urea sample buffer*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer*	Invitrogen	15581-044
* – for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm,	Millipore	XX1009020
ground joint flask 1 L ,	Millipore	XX1504705