Summary

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

Published: October 07, 2021
doi:

Summary

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Abstract

Son yıllarda, ribozomların sadece mRNA’mızın şifresini çözmekle kalmayıp, aynı zamanda polipeptit zincirinin kalabalık hücresel ortama ortaya çıkmasına rehberlik ettiği de ortaya çıkmıştır. Ribozomlar, membran hedefleme faktörlerinin uzamsal ve kinetik olarak kontrol edilen bağlanması, enzimlerin modifiye edilmesi ve şaperonların katlanması için platform sağlar. Yüksek dereceli oligomerik komplekslere ve protein-protein ağı oluşum adımlarına montajın bile sentezle koordine edildiği yakın zamanda keşfedilmiştir.

Burada, in vivo olarak eş-translasyonel etkileşimleri yakalamak için geliştirilmiş bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz. Ribozom-nazen-zincir komplekslerini ko-translasyonel interaktörlerle birlikte yakalamak için gereken çeşitli afinite saflaştırma adımlarını ve ayrıca kodona yakın çözünürlükte ko-translasyonel etkileşimleri deşifre etmek için gereken mRNA ekstraksiyonu, boyut dışlama, ters transkripsiyon, derin dizileme ve büyük veri analizi adımlarını detaylandıracağız.

Introduction

Selective Ribozom Profiling (SeRP), bugüne kadar, ko-translasyonel etkileşimleri, in vivo, doğrudan bir şekilde 1,2,3,4,5,6 olarak yakalayan ve karakterize eden tek yöntemdir. SeRP, ribozomların 2,7’ye yakın çözünürlükte çevrilmesiyle herhangi bir faktörün etkileşimlerinin global profillenmesini sağlar.

Yöntem, büyüyen hücrelerin flaş dondurulmasına ve aktif çevirinin korunmasına dayanır. Hücre lizatları daha sonra “ribozom ayak izleri” olarak adlandırılan ribozom korumalı mRNA fragmanları hariç hücredeki tüm mRNA’yı sindirmek için RNaz I ile muamele edilir. Numune daha sonra iki bölüme ayrılır; Bir kısım doğrudan tüm hücresel ribozomal ayak izlerinin izolasyonu için kullanılır ve hücrede devam eden tüm translasyonu temsil eder. İkinci bölüm, bir ilgi faktörü ile ilişkili ribozomların spesifik alt kümesinin afinite saflaştırılması için kullanılır, örneğin: enzimleri değiştirmek, translokasyon faktörleri, şaperonları katlamak ve karmaşık montaj etkileşimleri. Afinite saflaştırılmış ribozomal ayak izleri topluca interaktom olarak adlandırılır. Daha sonra, ribozom korumalı mRNA’lar ekstrakte edilir ve cDNA kütüphanesi üretimi için kullanılır, ardından derin dizileme yapılır.

Toplam translatom ve interaktom örneklerinin karşılaştırmalı analizi, ilgi faktörü ile ilişkili tüm orfların tanımlanmasına ve her bir orf etkileşim profilinin karakterizasyonuna izin verir. Bu profil, kodu çözülmüş kodonları ve ortaya çıkan polipeptit zincirinin ilgili kalıntılarını ve ayrıca etkileşim 7,8 sırasındaki ribozom hız değişimlerini çıkarabileceğiniz kesin katılım başlangıcı ve sonlandırma dizilerini rapor eder. Şekil 1’de protokol şematik olarak gösterilmektedir.

Figure 1
Şekil 1: SeRP protokolüne genel bakış. Bu protokol 7-10 gün içinde bütünüyle gerçekleştirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

1. Seçici Ribozom Profilleme için suşların oluşturulması NOT: Selective Ribozom Profiling (SeRP), ribozom-yeni ortaya çıkan zincir kompleksleri ile etkileşim tarzlarını değerlendirmek için ilgi faktörlerinin afinite saflaştırılmasına dayanan bir yöntemdir. Homolog rekombinasyon9 ve CRISPR / Cas910 tabanlı yöntemler, çeşitli ilgi çekici faktörleri afinite saflaştırmaları için etiketlerle birleştirme…

Representative Results

Bu protokolün akış şemasında gösterildiği gibi (Şekil 1), hücreler log fazına büyütüldü ve daha sonra filtrasyon ile hızlı bir şekilde toplandı ve kriyojenik öğütme ile lize edildi. Lisat daha sonra ikiye ayrıldı: biri toplam ribozom korumalı mRNA ayak izleri için, diğeri ise etiketli protein-ribozom-yeni doğan zincir komplekslerini aşağı çekmek için afinite saflaştırması yaptığımız seçilmiş ribozom korumalı mRNA ayak izleri için. <strong class="xfi…

Discussion

Burada, protokol, yakın kodon çözünürlüğünde ko-translasyonel etkileşimleri yakalamak için Seçici Ribozom Profilleme yaklaşımını detaylandırmaktadır. Ribozom, kalabalık sitoplazmaya yeni zincir oluşumunu koordine etmek için bir merkez olarak yükseldiğinden, bu, fonksiyonel bir proteom sağlamak ve çeşitli hastalıkları incelemek için gereken çeşitli ko-translasyonel etkileşimleri tanımlamak ve karakterize etmek için çok önemli bir yöntemdir. Bugüne kadar, SeRP bu etkileşimleri doğrud…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Verimli tartışmalar için tüm laboratuvar üyelerine ve makalenin eleştirel okuması için Muhammed Makhzumy’ye teşekkür ederiz. Bu çalışma ISF (İsrail Bilim Vakfı) hibe 2106/20 tarafından finanse edilmiştir.

Materials

3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide IDT custom order RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol VWR 20821
Acid phenol–chloroform Ambion AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA Merck 11583816001 12CA5
Aprotinin Roth A162.3
ATP* NEB P0756S 10 mM
Bacto agar BD 214030
Bacto peptone BD 211820
Bacto tryptone BD 211699
Bacto yeast extract BD 212720
Bestatin hydrochloride Roth 2937.2
Chloroform Merck 102445
CircLigase II ssDNA Ligase* Epicentre CL9025K 100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution Roth 4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics 29384100
Cycloheximide Biological Industries A0879
DEPC treated and sterile filtered water* Sigma 95284
D-Glucose anhydrous Merck G5767-500G
Diethylpyrocarbonate Roth K028
Dimethylsulfoxide* Sigma-Aldrich 276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler* Thermo Fisher Scientific SM1313
DNA loading dye* Thermo Fisher Scientific R0631
DNase I, recombinant Roche 4716728001 RNAse free
dNTP solution set* NEB N0446S
EDTA* Roth 8043
Glycerol VWR 24388.260.
Glycine solution Sigma-Aldrich 67419-1ML-F 1 M
GlycoBlue Ambion AM9516 15 mg/mL
HEPES Roth HN78.3
HF Phusion polymerase* NEB M0530L
HK from S. cerevisiae Sigma-Aldrich H6380-1.5KU
Hydrochloric acid AppliChem A1305
Isopropanol Sigma-Aldrich 33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Roth CN08
Kanamycin Roth T832.4
KCl Roth 6781.1
KH2PO4 Roth 3904.1
Leupeptin Roth CN33.4
Linker L(rt) IDT custom order
Liquid nitrogen
MgCl2 Roth KK36.3
Na2HPO4 Roth P030.2
Na2HPO4·2H2O Roth T879.3
NaCl* Invitrogen AM97606 5 M
NaH2PO4·H2O Roth K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads GE Life Sciences 17090601
Nonidet P 40 substitute Sigma 74385
Pepstatin A Roth 2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride Roth 6367
Precast gels Bio-Rad 5671034 10% and 12%
RNase I Ambion AM2294
SDS, 20% Ambion AM9820 RNase free
Sodium acetate* Ambion AM9740 3 M, pH 5.5
Sodium azide Merck S8032-100G
Sodium chloride Roth 9265
Sodium hydroxide* Sigma S2770 1 N
Sucrose Sigma-Aldrich 16104
SUPERase-In RNase Inhibitor Ambion AM2694
Superscript III Reverse Transciptase* Invitrogen 18080-044
SYBR Gold* Invitrogen S11494
T4 polynucleotide kinase* NEB M0201L
T4 RNA ligase 2* NEB M0242L
TBE polyacrylamide gel* Novex EC6215BOX 8%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC68752BOX 10%
TBE–urea polyacrylamide gel* Novex EC6885BOX 15%
TBE–urea sample buffer* Novex LC6876
Tris Roth 4855
Tris* Ambion AM9851 1 M, pH 7.0
Tris* Ambion AM9856 1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer* Invitrogen 15581-044
* – for library preparation
gasket and spring clamp , 90 mm, Millipore  XX1009020
ground joint flask 1 L , Millipore XX1504705

Referências

  1. Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  2. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  3. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  4. Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast. Nature Protocols. , (2019).
  5. Knorr, A. G., et al. Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).
  6. Matsuo, Y., Inada, T. The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway. Cell Reports. 34 (12), (2021).
  7. Döring, K., et al. Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding. Cell. , (2017).
  8. Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting. Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).
  9. Janke, C., et al. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes. Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).
  10. Levi, O., Arava, Y. Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae. Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).
  11. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
  12. . Illumina Index Adapters – Pooling Guide Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf (2019)
  13. Kanagawa, T. Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR). Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).
  14. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), (2021).
  15. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  16. Joazeiro, C. A. P. Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).
  17. Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820 (2017).
check_url/pt/62878?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Venezian, J., Zilberman, H., Shiber, A. Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (176), e62878, doi:10.3791/62878 (2021).

View Video