Мониторинг эстрального цикла грызунов с использованием вагинального лаважа: нет такой вещи, как нормальный цикл

Summary

В этом исследовании подробно описываются важнейшие факторы, которые следует учитывать в экспериментальных проектах с участием самок крыс. В более широком смысле эти данные служат снижению стигмы и помогают в разработке более инклюзивных диагностических и интервенционных инструментов.

Abstract

Нынешняя методология устанавливает воспроизводимый, стандартизированный и экономически эффективный подход к мониторингу эстрального цикла самок крыс-подростков Sprague Dawley (SD). Это исследование демонстрирует сложность гормональных циклов и широкий спектр понимания, необходимого для построения надежной и достоверной техники мониторинга. Благодаря углубленному изучению основных экспериментальных и процедурных элементов это описание цикла и его основополагающих принципов обеспечивает основу для дальнейшего понимания и деконструирует заблуждения для будущего воспроизведения.

Наряду с описанием процесса сбора образцов с использованием влагалищного лаважа, процедура описывает механизм категоризации данных в четырехступенчатую модель проэструса, течки, метеструса и диэструса. Эти стадии характеризуются новым предлагаемым подходом, использующим 4 категоризирующих детерминанты состояния влагалищной жидкости, типа (типов) клеток, расположения клеток и количества клеток во время сбора. Вариации каждого этапа, благоприятные и неблагоприятные выборки, различие между цикличностью и ацикличностью, а также графические изображения собранных компонентов категоризации представлены наряду с эффективной интерпретационной и организационной практикой данных. В целом, эти инструменты позволяют впервые публиковать поддающиеся количественной оценке диапазоны данных, что приводит к стандартизации коэффициентов категоризации при репликации.

Introduction

Новые вклады
Эстральный цикл грызунов был идентифицирован как важный показатель хорошего самочувствия. Однако бессознательные предубеждения исследователей и неточные интерпретации относительно женского тела мешают научному сообществу. Сама этимология слова «эструс» подразумевает чувство неполноценности и негатива. Еврипид использовал этот термин для описания «безумия» или безумия, Гомер для описания паники, а Платон для описания иррационального влечения. Это исследование подчеркивает, как эти первобытные перспективы влияют на современное научное сообщество и решают эти проблемы с помощью новой мозаичной парадигмы — обновленной комбинации ранее изученных методов, расширенных по охвату для более комплексного подхода.

Изучение и использование этого метода необходимы, во-первых, поскольку не существует стандартизированного и всеобъемлющего метода мониторинга, а практика интерпретации данных может быть неясной. Во-вторых, хотя характеристики эстрального цикла зависят от отдельных изучаемых крыс, они часто универсализируются. В-третьих, хотя гормональные циклы являются рутинными и полезными процессами, они окружены опасной стигмой, исследуемой в разделе «Перевод на людей». Это исследование направлено на решение этих трех проблем тремя способами: (А) путем описания углубленной техники мониторинга эстрального цикла и уточнения того, как результаты могут быть интерпретированы, (В) путем изложения методов, которые поддерживают целостность и индивидуальность каждого цикла, и (В) путем привлечения внимания к заблуждениям, которые увековечивают необоснованную практику.

Это исследование также уникально в своем фокусе на крысах-подростках, период, отмеченный критическими изменениями в развитии, которые проливают свет на различные поведенческие, анатомические и физиологические проявления во взрослом возрасте¹. Построение стандартизированной экспериментальной конструкции для мониторинга гормональных циклов в недостаточно изученной популяции при одновременной деконструкции общих предубеждений позволит разработать надежные и достоверные гормональные корреляции ^2,3,4 и определить зависящие от состояния нарушения цикла ^5,6,7,8,9,10 . В конечном счете, эти новинки служат для расширения диагностических критериев, методов лечения и вмешательств различных проблем здоровья.

Основные определения и виды использования
Эстрозный цикл представляет собой совокупность динамических физиологических процессов, которые происходят в ответ на три колеблющихся женских половых стероидных гормона: эстрадиол, лейтеинизирующий гормон (ЛГ) и прогестерон (рисунок 1А, В). Взаимодействия между эндокринной и центральной нервной системой регулируют цикл, который чаще всего сохраняется в течение 4-5 дней и повторяется с начала полового созревания до репродуктивного старения и / или прекращения. Он делится на отдельные категории в зависимости от уровня гормонов – чаще всего на 4 стадии диэструса (DIE), проэструса (PRO), течки (EST) и метеструса (MET), которые прогрессируют по кругу. Количество делений может варьироваться от 3^{стадий 11} до 13 стадий¹², в зависимости от характера исследования¹³. Меньшее число делений часто исключает НДПИ как стадию и классифицирует ее как кратковременный переходный период. Большее число обычно включает подразделы, которые позволяют более внимательно изучить такие явления, как развитие опухоли или спонтанная псевдоберемень, физиологическое состояние беременности без эмбриональной имплантации 12,14,15.

В этом исследовании стадии были идентифицированы через компоненты влагалищного канала, названные 3 категоризирующими детерминантами – тип (типы) клеток присутствуют, расположение клеток и количество клеток (рисунок 2A-D). Хотя состояние влагалищной жидкости не контролировалось в этом исследовании, рекомендуется включить ее в качестве четвертого категоризирующего компонента. Дополнительную информацию об исследовании влагалищной жидкости можно найти в списке литературы¹⁶. Компоненты категоризации могут быть исследованы путем извлечения клеток с помощью вагинального лаважа, основного метода, рекомендуемого в современном мониторинге эстрального цикла. В то время как углубленные физиологические процессы на каждом этапе выходят за рамки данного исследования, более подробную информацию можно найти в литературе¹⁷.

Использование и дальнейшее развитие этого метода мониторинга эстрального цикла коренится в связях между половыми стероидными гормонами и функцией систем организма, таких как сердечно-сосудистая система¹⁸, эндокринная система⁸ и центральная нервная система 19,20,21. В то же время мониторинг эстрального цикла не всегда может быть необходим, когда участвуют самки грызунов 22,23,24,25. Скорее, важно сначала рассмотреть, были ли зарегистрированы половые различия в конкретной области исследования, которые могут быть дополнительно изучены в опубликованных обзорах^22,23. Хотя мониторинг эстрального цикла имеет жизненно важное значение в широком спектре исследовательских исследований, его не следует рассматривать как препятствие для включения самок грызунов в эксперименты. Хотя этот метод может показаться сложным и трудоемким, сама процедура может занять менее 15 минут, в зависимости от исследователя, и является экономически эффективной. В целом, включение самок грызунов в научные исследования выгодно для понимания систем организма, различных состояний и патологий, а также общего самочувствия, поскольку эти разработки были в основном основаны на шаблоне мужского тела.

Универсальные параметры и естественные изменчивости у грызунов
Установление диапазонов для аспектов, рассматриваемых как «типичные», необходимо для определения стандартных моделей циклов, задания параметров для сравнительных и аналитических целей и выявления аномалий и выбросов. В то же время важно также признать, что цикл каждой крысы уникален, и ожидаются отклонения, основанные на штамме животных, физиологических процессах и условиях окружающей среды. На самом деле, одним из самых «нормальных» аспектов эстрального цикла является изменчивость. Это видно по общей продолжительности цикла, с диапазоном 3-38 дней^26,27; возраст полового созревания, который может варьироваться от 32-34 дней до нескольких недель 28,29,30; то, что считается ациклическим¹¹, и категоризация детерминантных паттернов^11,13. В целом, не существует универсального шаблона для эстрального цикла, и перевод его как для научного сообщества, так и для широкой общественности является важной частью экспериментального процесса.

Экспериментальные временные точки и возраст развития
Признание этого принципа изменчивости помогает в построении надежного и обоснованного экспериментального проекта. Например, начало мониторинга эструсного цикла зависит от анатомического и физиологического развития крыс, которое варьируется в зависимости от экологических и физиологических факторов. Мониторинг не может начаться до развития влагалищного отверстия (VO), которое представляет собой наружное влагалищное отверстие, окруженное вульвой, которая ведет во внутреннюю часть вагинального канала (рисунок 3A-D). В то время как VO часто полностью развивается в возрасте от 32 до 34 дней, он остается индивидуализированным для каждого субъекта, и многое в этом процессе остается неизвестным. Это отверстие было использовано для выявления начала полового созревания, которое было связано с увеличением эстрадиола³¹, созреванием гипоталамо-гипофизарно-яичниковой оси³² и первой овуляцией у крыс 17,33,34,35. Тем не менее, недавние публикации показали, что он является лишь косвенным маркером репродуктивного развития, поскольку он может стать несвязанным с гормональными явлениями и явлениями развития в неблагоприятных условиях³¹ и может представлять изменения в уровнях эстрадиола, а не половое созревание³³. Поэтому рекомендуется не полагаться исключительно на VO для определения возраста развития и в качестве квалификатора для мониторинга эстрального цикла³⁶, но также использовать появление первой стадии EST и ороговение эпителиальных клеток³⁰, чтобы отметить начало полового созревания.

Масса тела заметно коррелирует с возрастом развития в подростковом периоде у грызунов^30,37 и поэтому также может помочь в определении возраста развития в этот период. Предложенные механизмы, связанные с этим явлением, включают стимуляцию гормонов, необходимых для репродуктивного развития, таких как гормон роста, и ингибирование гипоталамо-гипофизарной надпочечниковой оси (HPA) регулятором аппетита, лептином³⁰. Тем не менее, не рекомендуется использовать этот показатель в качестве единственного показателя возраста развития из-за большой разницы, наблюдаемой между крысами между видами и поставщиками^{поставщиков 38}. Изменчивость, наблюдаемая в развитии VO и массы тела, иллюстрирует важность концепции в общем экспериментальном процессе.

Перевод на человека: культурный и научный контекст
Трансляционная связь репродуктивных исследований животных и человека является двунаправленной. Результаты исследований на животных влияют на то, как оцениваются, подходят и анализируются человеческие процессы³⁹. Восприятие репродуктивной системы человека и связанных с ней процессов влияет на то, как изучаются животные. На самом деле, одним из самых громких указаний для дальнейших исследований в этой области являются предвзятые социокультурные убеждения, связанные с гормональными циклами, которые влияют на научный процесс. Многие из этих условностей проистекают из общего культурного отвращения к обсуждению менструации, что привело к пробелу в данных в хорошо обоснованных знаниях^40,41. Это имеет спектр последствий, которые варьируются от незначительных до смертельных — от высоты стеллажей и размера смартфона до полицейской установки бронежилетов и пропущенных диагнозов рака⁴².

Описание менструации как антисанитарной, разрушительной и токсичной, которую можно увидеть в почитаемых текстах, средствах массовой информации, словарях и медицинских учениях, сохраняется научными публикациями. Это происходит из-за неточных и предвзятых описаний гормональных циклов, изоляции репродуктивной системы от ее нейроэндокринных аналогов и влияний окружающей среды, а также редукционистской перспективы завершения цикла как «неспособности забеременеть^»43,44. Это приводит к созданию необоснованных экспериментальных практик, таких как отсутствие внешних переменных, которые влияют на гормональные циклы, определение начальных и конечных точек, основанных исключительно на анатомических разработках, и измерение продвижения цикла линейным, а не круговым образом. Несмотря на прямую корреляцию между социокультурными факторами и биологическими последствиями, она не часто рассматривается в научной литературе. Изучая более целостные публикации 43,44,45, исследователи могут деконструировать эти стигмы и создавать более надежные и валидные экспериментальные проекты.

Protocol

Все методы обработки и процедуры, изложенные в этом протоколе, соответствуют руководящим принципам по уходу за животными и их использованию Национальными институтами здравоохранения (NIH) и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Универс…

Representative Results

Текущие данные отражают данные о женском подростковом SD International Genetic Standardization Program (IGS) в присутствии самцов крыс SD. Эти животные были обнаружены как в лабораториях Университета Пеппердайна, так и в лабораториях UCLA в рамках совместного исследования. На рисунке 5 представле…

Discussion

Ключевые шаги и важные соображения
Некоторые критические шаги в предоставленном протоколе требуют акцента, особенно в коллекции вагинальных клеток. Во время экстракции влагалищной жидкости обеспечение надлежащего угла и глубины введения шприца является ключом к получени?…

Materials

AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip – 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4