כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.
טומוגרפיית קריו-אלקטרונים (cryo-ET) הפכה לשיטת הבחירה לחקר אולטרה-מבנה תאי וקומפלקסים מולקולריים במצבם הטבעי, קפוא. עם זאת, cryo-ET דורש שהדגימות יהיו דקות מספיק כדי לא לפזר או לחסום את קרן האלקטרונים של האירוע. עבור דגימות תאיות עבות, ניתן להשיג זאת על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת הקפאה (FIB). פרוטוקול זה מתאר כיצד להתמקד באתרים סלולריים ספציפיים במהלך כרסום FIB באמצעות גישה תלת-ממדית מתאמת, המשלבת נתוני מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת-ממדי עם מידע ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק FIB. באמצעות טכניקה זו, ניתן למקד אירועים ומבנים תאיים נדירים בדיוק גבוה ולהמחיש אותם ברזולוציה מולקולרית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-שידור (cryo-TEM).
כרסום קרן יונים ממוקד מאפשר הכנת דגימות ביולוגיות דקות מדגימות קבועות בהקפאה ללא הבעיות הקשורות בדרך כלל לחתכים מכניים כגון סימני סכין וחפצי דחיסה1. בשילוב עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית, כרסום FIB מאפשר מחקרים ביולוגיים ברזולוציה גבוהה של המורפולוגיה התאית וקביעת המבנה של קומפלקסים מקרומולקולריים ישירות מתוך תאים ברזולוציה תת-ננומטרית 2,3,4. בעוד מינים רבים, כגון ריבוזומים, נמצאים בקלות בלמלות FIB שנחתכו באופן אקראי, תהליכים תאיים רבים מסתמכים על קולוקליזציה של מספר קומפלקסים או ממוקמים לאתרים ספציפיים בתוך התא. כתוצאה מכך, מיקוד יעיל נדרש כדי לא לאבד את התכונה הביולוגית של עניין במהלך תהליך הכרסום ולהיות מוגבל לפגיעות אקראיות. לכן יש צורך בגישה מתאמתית המשלבת נתונים ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)-FIB ומיקרוסקופ אור קריו-פלואורסצנטי (FLM). בעוד שניתן להשמיט את המתאם הראשוני ולשלב נתוני FLM ו- cryo-ET רק לאחר רכישת TEM5,6, כרסום קרן יונים ממוקד מונחה פלואורסצנטיות מאפשר בחירה מדויקת של אזור הכרסום מראש, ובכך מביא לאיסוף נתונים יעיל יותר. מאז תפיסתו7, היישום של כרסום FIB מתואם תלת-ממד במחקרים ביולוגיים היה מוגבל עד שדיווחנו לאחרונה על זיהוי תא חדש המופרד פאזה נוזלי-נוזלי (LLPS) בשמרים באמצעות טכניקה זו8.
מתואר כאן פרוטוקול מיקרוסקופ אור ואלקטרונים תלת-ממדי מתואם קריו-ממדי (CLEM), שניתן להשתמש בו כדי לחקור מגוון רחב של דגימות, החל מחיידקים ועד תאי שמרים ויונקים. בעוד שהניסויים בוצעו באמצעות סט מסוים של מכשירים, השלבים הבודדים אינם כבולים לחומרה ספציפית וניתן להעביר אותם בקלות למערכות אחרות כהרחבה לפרוטוקולים קיימים 3,5. רשימה של ציוד נבדק והגדרות מוצעות מופיעות בטבלת החומרים ובטבלה 1. ארבעת השלבים העיקריים של הצינור הם: (1) הכנת דגימות, (2) לוקליזציה של תכונות מעניינות באמצעות מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, (3) כרסום קרן יונים ממוקד במתאם תלת-ממדי, ו-(4) לוקליזציה של המבנים המיועדים לרכישת נתוני קריו-ET על הלאמות במיקרוסקופ אלקטרונים קריו-הולכה (איור 1).
1. שלבים קריטיים בפרוטוקול
אופטימיזציה של תרבית תאים ופרמטרים של צניחת רשת היא בסיסית עבור זרימת עבודה זו. בתחילת הפרויקט, כדאי להשקיע זמן כדי לייעל אסטרטגיות תיוג, את התפלגות התאים ואת חרוזי fiducial, ולבדוק פרמטרים שונים של הכנת רשת ו blotting. עבודה עם דגימה קפואה אופטימלית תקל באופן משמעותי על עיבוד במורד הזרם.
כמו בכל ניסוי TEM, דגימות זגוגית נדרשות. עבור תאי יונקים גדולים כגון HeLa, 1-2 תאים לכל ריבוע רשת עדיפים, אך תאים עדיין עשויים להיות זגוגיים בצפיפות גבוהה יותר. לחלופין, ניתן לשפר את הוויטריפיקציה בתאי יונקים (למשל, HEK293, HeLa) על ידי דגירה שלהם עם גליצרול של 2.5-10% (v/v) שנוסף למדיום התרבית 10 דקות לפני צלילה23. במידת האפשר, ניתן להשתמש בתבניות רשת כדי להבטיח מיקום ופיזור מושלמים של התאים, ובכך לשפר את הוויטריפיקציה ומתאם מאוחר יותר24.
בעוד שניתן לבחור תאים ספציפיים במהלך זרימת העבודה, מעט מדי תאים המציגים את התכונה הביולוגית המעניינת יפחיתו באופן משמעותי את התפוקה הכוללת. כדי לשפר את המתאם בתאים חיוביים POI, יש להשתמש בפלואורופורים בהירים מספיק. זה חשוב במיוחד ברמות ביטוי אנדוגניות. מצאנו כי בתנאי קריו, mVenus לעתים קרובות תפקד טוב יותר מאשר EGFP בשל בהירותו המוגברת25 והשינוי ההיפסוכרומי, מה ששומר אותו מתאים להגדרות מסנן GFP סטנדרטיות בתנאי הקפאה26. עבור מבני מטרה שאינם דמויי נקודה, יש לשקול גם את הפשרה בין אורך גל לדיוק לוקליזציה (גבול עקיפה של Abbe).
מתאם תלת-ממדי יעיל דורש גם שהרשתות יהיו יציבות מבחינה מכנית ויטופלו בזהירות רבה. בעוד שניתן להשתמש ברשתות זהב או נחושת סטנדרטיות עם תמיכת פחמן, ניתן להגדיל את שיעור ההצלחה באופן משמעותי על ידי שימוש בסרטי SiO2 קשיחים יותר בהתאם לפרויקט. עם זאת, עדיין לא נקבע באופן חד משמעי אם (א) יציבות מכנית או (ב) מקדמי התפשטות תרמית תואמים (מצע לעומת יריעה) להפחתת קמטים בהקפאה27, הם הגורם המכריע ביותר למתאם תלת-ממדי מוצלח. יתר על כן, עבור להרים רשתות Au שבירות, מנות מצופות polydimethylsiloxane ניתן להשתמש5.
בנוסף להבטחת יציבות הדגימה, יש צורך בבחירה זהירה של פרמטרי הדמיה FLM לקבלת ערימות פלואורסצנטיות באיכות גבוהה המתאימות למיקוד אופטימלי במהלך כרסום FIB. בהקשר זה, מומלץ גם לבדוק טכניקות שונות של denoising28 או deconvolution על נתוני FLM, שכן הוא עשוי לשפר במידה ניכרת את הלוקליזציה של fiducials ואותות סלולריים. כאשר מקשרים את האות הפלואורסצנטי לתמונות FIB-SEM, דגימה טובה של חרוזים פידוקיאליים חשובה. הם צריכים להיות מפוזרים היטב סביב התאים ואולי בגבהים z שונים. זה גם נוהג טוב לאמת את עקביות המתאם על ידי בדיקת המיקומים החזויים לעומת בפועל של חרוזים שהושארו בכוונה מחוץ למודל הפידוקיאלי אך ניתן לתאם בבירור בעין. יש לשקול תמיד גם את ערכי RMSE של 3DCT כדי לבדוק את עקביות הרישום.
מכיוון שקיעת חומר טחון ומים שיוריים מתא FIB-SEM (כלומר, זיהום מחדש) מגדילה את עובי הלמלה האפקטיבי על ידי הוספת חומר אמורפי לשני צדדיו, שמירה על למלות טחונות עדינות במיקרוסקופ למשך זמן ממושך בדרך כלל מפחיתה את איכות נתוני TEM עקב אירועי פיזור אלקטרונים נוספים. לפיכך, כרסום מבוצע לרוב בצורה דו-שלבית: ראשית, כל המיקומים נטחנים בערך (כלומר, לכ 800 ננומטר), ולאחר מכן דק (ל~ 150-250 ננומטר), והרשת נפרקת מיד לאחר השלמת הלמלה האחרונה. עם זאת, ניתן להשיג הצלחה קורלציונית טובה יותר על ידי עיבוד עמדות העניין באופן חכם באתר, ומכאן ביצוע כרסום גס ועדין על אותה למלה ישירות זו אחר זו, שכן זה לא משאיר זמן לכיפוף או עיוות. זה, עם זאת, מפחית את המספר המרבי של lamellas שניתן לייצר בכל רשת בהתאם לקצב זיהום מחדש של המערכת. בקצב של 20 ננומטר / שעה, 4-6 lamellas מיוצרים בתוך 1-1.5 שעות.
תנועה של הרשת כולה או של הלאמלות הגסות >300 ננומטר תגרום למתאם גרוע או לא מוצלח (ראו גם מגבלות שיידונו להלן). לכן יש לבדוק אותו באופן קבוע, למשל על ידי השוואת תמונות IB לפני, במהלך ואחרי כרסום FIB. אתרים המראים תנועה משמעותית (>300 ננומטר) יש להשליך. מטב את הכנת הדגימה (כלומר, בחירת סוג הרשת, צפיפות התא ופרמטרים של צלילה; ראה פרוטוקול סעיף 1) ואסטרטגיית כרסום כדי למנוע תנועות אלה. ניתן להפחית באופן משמעותי את כיפוף הלמלה על ידי כרסום מבחינת האתר כמתואר בשלב 3.6 והקטנת רוחב הלמלה. כפי שהוזכר קודם, בעוד חתכים להפגת מתח 15 תוכננו כדי להפחית את כיפוף הלמלה, הם לעתים קרובות גורמיםלתנועה מתואמת של הלמלה המנותקת, ובכך מונעים למעשה קורלציה. ניתן להשתמש במערכות FLM משולבות כדי לפתור בעיה זו.
2. שינויים ובעיות של השיטה
מומלץ מאוד לבצע אפיון יסודי של הדגימה בהדמיה של תאים חיים לפני היציאה לתנאי הקפאה. אופטימיזציה של דגימות התאים, תוכניות הטיפול, והידיעה לאיזה סוג של אות לצפות לפני הכניסה לזרימת העבודה הקרויה יכולה לשפר באופן משמעותי את שיעור ההצלחה שלה.
בתהליך העבודה המוצג כאן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי עצמאי עם שלב קריו-שלב משמש לצילום הדגימות, ואחריו העברה של הרשתות למיקרוסקופ קרן היונים הממוקדת. עם זאת, הוא נבדק על מערכות שבהן מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב בתא FIB-SEM, ולכן אין צורך בהעברת דגימה כדי לקבל תמונות פלואורסצנטיות 29,30,31. באמצעות מערכות משולבות כאלה, ניתן לצלם עמדות עניין במהלך כרסום FIB ולאחריו כדי לבדוק את נוכחותו של אות הפלואורסצנטיות של המטרה מבלי להגדיל את הסיכון לזיהום הלמלות הסופיות. עם זאת, חשוב לזכור את הפרמטרים האופטיים של המיקרוסקופים המשומשים, כמו, למשל, מטרת NA נמוכה תגביל את הדיוק שבו ניתן למקם חרוזים ואותות מטרה. עם זאת, הגדרות FLM משולבות יסייעו גם להתמודד טוב יותר עם עיוותים קלים של רשתות ולמלות, מכיוון שניתן לעדכן באופן רציף ערימות FLM ולהשוות אותן לתצוגות SEM ו- IB עדכניות.
כחלופה להדמיית פלואורסצנטיות של הלמלה בין כרסום FIB ורכישת נתוני TEM, ניתן להשתמש בקורלציה שלאחר TEM כדי לאמת מיקום וכרסום נכונים של הלמלות 5,6.
במהלך כל השלבים של זרימת העבודה המתאמת, אך במיוחד במהלך TEM, מומלץ ליצור שכבת-על של נתוני הפלואורסצנטיות המוקרנים בתמונות FIB-SEM/TEM. השקפות CLEM קלאסיות כאלה עוזרות להבין באופן אינטואיטיבי יותר איזה חלק של התאים נמצא בתוך הלאמלות. זה משמש גם כבדיקת שפיות שימושית כדי לאמת את דיוק הקורלציה.
3. מגבלות השיטה
גישת FIB עם מתאם תלת-ממדי דורשת דגימות שניתן לספק עם חרוזים fiducial. בהתאם לכך, שיטה זו מוגבלת כיום לרשתות קפואות. עבור דגימות קפואות (רקמות) בלחץ גבוה (HPF), כיום ניתן לבצע רק מתאמים דו-ממדיים. באופן פוטנציאלי, סמנים פידוקיאליים פנימיים (למשל, אברונים, טיפות שומנים מוכתמות) יכולים להיות פתרון לבעיה זו32,33. שיעור ההצלחה הסופי של המתאם תלוי בגורמים רבים, כולל איכות הדגימה, מערך המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, עובי הלמלה וגודל מבנה היעד. דיוק המתאם באמצעות גישת הרישום התלת-ממדית המתוארת מוערך בטווח של 200-300 ננומטר בתמונת IB הסופית, המקביל בערך לעובי האופייני של למלותטחונות FIB 7. בהתאם לכך, מבנים תאיים קטנים בהרבה מזה יהיה קשה למיקוד כרגע. בנוסף, תנועה מוגזמת באתר הכרסום (>300 ננומטר) מפחיתה גם היא את דיוק הקורלציה, בעיה שניתן לטפל בה באמצעות הגדרות FLM המשולבות במכשירי FIB/SEM. Lamellas המראים עיוות חזק או כיפוף במהלך כרסום צריך, בכל מקרה, להיות מחוץ זרימת העבודה במורד הזרם.
בסך הכל, הדמיית קריו-פלואורסצנטיות מוגבלת כיום על ידי קריטריון עקיפה של Abbe. עם יישום שגרתי יותר (ומסחור) של שיטות cryo-FLM סופר-פתורות, מיקוד מדויק יותר של מבנים סלולריים עשוי להיות אפשרי, במיוחד כאשר משולבים ב- FIB/SEM לפעולה תוך כדי תנועה.
4. משמעות השיטה
במיוחד בהשוואה לטכניקות לא ממוקדות ופוסט-קורלציה, גישת כרסום FIB במתאם תלת-ממדי מאפשרת בחירת מיקומים מתאימים לפני שלב TEM הגוזל זמן ומשאבים. בכך הוא מאפשר איסוף נתונים יעיל יותר ותכנון פרויקטים. יתר על כן, הנתונים הפלואורסצנטיים המתואמים מוסיפים שכבת מידע שיכולה להיות חיונית לפענוח הטומוגרפיה ולשילוב תוצאות cryo-ET בפרויקטים בקנה מידה גדול, במיוחד כאשר מדובר במכלולי חלבונים לא מובנים או כאלה קטנים מדי להתאמת תבניות וממוצע תת-טומוגרפיה.
5. חשיבות ויישומים עתידיים פוטנציאליים
בשילוב עם זרימות עבודה מתקדמות כגון הרמת הקפאה מתוך דגימות HPF 34,35, נפח cryo-FIB-SEM 36 והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה מעולה26,37,38,39, הכנת למלה ממוקדת תלת-ממד מציעה את האפשרות לא רק לנתח תהליכים ביולוגיים בתאים מבודדים, אלא גם להפוך דגימות רקמות וחולים לנגישות לכרסם FIB וטומוגרפיה של אלקטרונים קריו-אלקטרונים. ככזה, הוא יאפשר דיסקציה של תהליכים פתולוגיים ברזולוציה גבוהה ובכך יהווה אבן בניין אינטגרלית לקראת ביופסיה בקנה מידה ננומטרי.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לאינגה וולף על התמיכה בתשתית ה-IT, לפלוריאן בק על התמיכה החישובית, ולאודה ה. שיוץ על הקריאה הביקורתית של כתב היד. המימון ניתן בחלקו באמצעות מלגת אלכסנדר פון הומבולדט לפיליפ ס. ארדמן ומלגת EMBO לטווח ארוך ALTF 764-2014 לפלוריאן וילפלינג. אנה ביבר נתמכה על ידי מלגת Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D.
Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |