Her presenterer vi en rørledning for 3D-korrelativ fokusert ionstrålefresing for å veilede fremstillingen av cellulære prøver for kryo-elektrontomografi. 3D-posisjonen til fluorescerende merkede proteiner av interesse bestemmes først ved kryofluorescensmikroskopi, og deretter målrettet for fresing. Protokollen er egnet for pattedyr-, gjær- og bakterieceller.
Kryo-elektrontomografi (kryo-ET) har blitt den valgte metoden for å undersøke cellulær ultrastruktur og molekylære komplekser i deres innfødte, frosne hydrerte tilstand. Kryo-ET krever imidlertid at prøvene er tynne nok til ikke å spre eller blokkere den innfallende elektronstrålen. For tykke celleprøver kan dette oppnås ved kryofokusert ionstråle (FIB) fresing. Denne protokollen beskriver hvordan man målretter mot spesifikke cellulære steder under FIB-fresing ved hjelp av en 3D-korrelativ tilnærming, som kombinerer tredimensjonale fluorescensmikroskopidata med informasjon fra FIB-skanningselektronmikroskopet. Ved hjelp av denne teknikken kan sjeldne cellulære hendelser og strukturer målrettes med høy nøyaktighet og visualiseres ved molekylær oppløsning ved hjelp av kryotransmisjonselektronmikroskopi (cryo-TEM).
Fokusert ionstrålefresing tillater fremstilling av tynne biologiske prøver fra kryofaste prøver uten problemene som vanligvis er forbundet med mekaniske seksjoneringer som knivmerker og kompresjonsartefakter1. Når parret med kryo-elektrontomografi, muliggjør FIB-fresing høyoppløselige biologiske studier av cellulær morfologi og bestemmelse av strukturen til makromolekylære komplekser direkte fra celler ved sub-nanometeroppløsning 2,3,4. Mens rikelig arter, som ribosomer, lett finnes i tilfeldig kuttede FIB-lameller, er mange cellulære prosesser avhengige av samlokalisering av flere komplekser eller er lokalisert til bestemte steder i cellen. Følgelig kreves effektiv målretting for ikke å miste den biologiske egenskapen av interesse under freseprosessen og være begrenset til tilfeldige treff. En korrelativ tilnærming som kombinerer data fra skanningselektronmikroskopet (SEM)-FIB og et kryofluorescenslysmikroskop (FLM) er derfor nødvendig. Selv om det er mulig å utelate den opprinnelige korrelasjonen og kombinere FLM- og kryo-ET-data først etter TEM-oppkjøp5,6, muliggjør fluorescensstyrt fokusert ionstrålefresing et nøyaktig valg av freseområdet på forhånd, noe som resulterer i mer effektiv datainnsamling. Siden unnfangelsen7 hadde anvendelsen av 3D-korrelert FIB-fresing i biologiske studier vært begrenset til vi nylig rapporterte å identifisere et nytt væske-væske faseseparert (LLPS) rom i gjær ved hjelp av denne teknikken8.
Beskrevet her er en generalisert 3D-kryokorrelert lys- og elektronmikroskopi (CLEM) protokoll, som kan brukes til å studere et bredt spekter av prøver som spenner fra bakterier til gjær og pattedyrceller. Mens eksperimentene ble utført ved hjelp av et bestemt sett med instrumenter, er de enkelte trinnene ikke bundet til spesifikk maskinvare og kan enkelt overføres til andre systemer som en utvidelse til eksisterende protokoller 3,5. En liste over testet utstyr og foreslåtte innstillinger er gitt i materialfortegnelsen og tabell 1. De fire hovedtrinnene i rørledningen er (1) prøvepreparering, (2) lokalisering av egenskaper av interesse ved kryofluorescensmikroskopi, (3) 3D-korrelert fokusert ionstrålefresing og (4) lokalisering av målrettede strukturer for kryo-ET-datainnsamling på lamellene i kryotransmisjonselektronmikroskopet (figur 1).
1. Kritiske trinn i protokollen
Optimalisering av cellekultur og gitterstupeparametere er grunnleggende for denne arbeidsflyten. I begynnelsen av et prosjekt er det verdt å investere tid for å optimalisere merkingsstrategier, fordeling av celler og fiducialperler, og teste forskjellige rutenettforberedelses- og blottingsparametere. Arbeid med en optimalt stupfrosen prøve vil legge betydelig til rette for nedstrømsbehandling.
Når det gjelder ethvert TEM-eksperiment, er det nødvendig med glassprøver. For store pattedyrceller som HeLa, er 1-2 celler per rutenettkvadrat å foretrekke, men celler kan fortsatt være glassaktige ved høyere tetthet. Eventuelt kan vitrifisering forbedres i pattedyrceller (f.eks. HEK293, HeLa) ved å inkubere dem med 2,5-10% (v / v) glyserol tilsatt til kulturmediet 10 minutter før det stuper23. Hvis tilgjengelig, kan rutemønster brukes til å sikre perfekt plassering og distribusjon av cellene, og dermed forbedre vitrifikasjon og senere korrelasjon24.
Mens spesifikke celler kan velges under arbeidsflyten, vil for få celler som viser den biologiske egenskapen av interesse, redusere den totale gjennomstrømningen betydelig. For å forbedre korrelasjonen i POI-positive celler, bør tilstrekkelig lyse fluoroforer brukes. Dette er spesielt viktig på endogene uttrykksnivåer. Vi fant ut at under kryoforhold presterte mVenus ofte bedre enn EGFP på grunn av den økte lysstyrken25 og det hypsokrome skiftet, noe som holder den egnet for standard GFP-filteroppsett under kryoforhold26. For ikke-punktlignende målstrukturer bør også avveiningen mellom bølgelengde og lokaliseringsnøyaktighet (Abbe-diffraksjonsgrense) vurderes.
Effektiv 3D-korrelasjon krever også at nettene er mekanisk stabile og håndteres med stor forsiktighet. Mens standard gull- eller kobbergitter med karbonstøtte kan brukes, kan suksessraten økes betydelig ved å bruke stive SiO2-filmer , avhengig av prosjektet. Imidlertid er det ennå ikke endelig bestemt om (a) mekanisk stabilitet eller (b) matchende termiske ekspansjonskoeffisienter (substrat vs. film) for å redusere kryorynker27, er den mest avgjørende faktoren for vellykket 3D-korrelasjon. Videre, for å plukke opp skjøre Au-nett, kan polydimetylsiloksanbelagte retter brukes5.
I tillegg til å sikre prøvestabilitet, er et nøye valg av FLM-bildeparametere nødvendig for å oppnå fluorescensstabler av høy kvalitet som er egnet for optimal målretting under FIB-fresing. I denne forbindelse anbefales det også å teste forskjellige denoising28 – eller dekonvolusjonsteknikker på FLM-dataene, da det kan forbedre lokaliseringen av fiducials og cellulære signaler betydelig. Når fluorescenssignalet korreleres til FIB-SEM-bilder, er det viktig med en god prøvetaking av fiducialperler. De skal være godt fordelt rundt cellene og eventuelt i ulike z-høyder. Det er også god praksis å validere konsistensen av korrelasjonen ved å sjekke de forutsagte vs. faktiske posisjonene til perler som bevisst ble utelatt fra fiducialmodellen, men som tydelig kan korreleres med øyet. 3DCTs RMSE-verdier bør også alltid vurderes for å kontrollere registreringskonsistensen.
Siden avsetning av frest materiale og restvann fra FIB-SEM-kammeret (dvs. rekontaminering) øker den effektive lamelltykkelsen ved å tilsette amorft materiale på begge sider av det, reduserer finmalte lameller i mikroskopet i lengre tid generelt TEM-datakvaliteten på grunn av ytterligere elektronspredningshendelser. Følgelig utføres fresing oftest på en to-trinns måte: først blir alle posisjoner malt omtrent (dvs. til ca. 800 nm), og deretter fint (til ~ 150-250 nm), og rutenettet blir umiddelbart losset etter at den siste lamellen er fullført. Bedre korrelasjonssuksess kan imidlertid oppnås ved å behandle posisjonene av interesse på en stedsvis måte, og dermed utføre grov og fin fresing på samme lamell rett etter hverandre, siden dette ikke gir tid til bøying eller deformasjon. Dette reduserer imidlertid det maksimale antallet lameller som kan produseres per rutenett, avhengig av rekontamineringshastigheten til systemet. For en hastighet på 20 nm / t produseres 4-6 lameller innen 1-1,5 timer.
Bevegelse av hele risten eller de grovmalte lamellene >300 nm vil resultere i dårlig eller mislykket korrelasjon (se også begrensninger diskutert nedenfor). Det bør derfor kontrolleres jevnlig, for eksempel ved å sammenligne IB-bilder før, under og etter FIB-fresing. Nettsteder som viser betydelig bevegelse (>300 nm) bør kastes. Optimaliser prøveprepareringen (dvs. valg av rutenetttype, celletetthet og stupende parametere; se protokollseksjon 1) og fresestrategi for å unngå disse bevegelsene. Lamellbøying kan reduseres betydelig ved stedsvis fresing som beskrevet i trinn 3.6 og ved å redusere lamellbredden. Som nevnt tidligere, mens stressavlastningskutt15 er designet for å redusere lamellbøying, resulterer de ofte i en samordnet bevegelse av den frakoblede lamellen, og forhindrer dermed korrelasjon effektivt. Integrerte FLM-systemer kan brukes til å løse dette problemet.
2. Modifikasjoner og feilsøking av metoden
Det anbefales sterkt å utføre en grundig karakterisering av prøven i levende celleavbildning før du går til kryoforhold. Optimalisering av celleprøver, behandlingsskjemaer og å vite hva slags signal du kan forvente før du går inn i kryoarbeidsflyten, kan forbedre suksessraten betydelig.
I arbeidsflyten som presenteres her, brukes et frittstående fluorescensmikroskop med et kryotrinn til å avbilde prøvene, etterfulgt av en overføring av rutenettene til det fokuserte ionstrålemikroskopet. Det har imidlertid blitt testet på systemer der et fluorescensmikroskop er integrert i FIB-SEM-kammeret, og derfor er det ikke nødvendig med prøveoverføring for å skaffe fluorescensbilder 29,30,31. Ved hjelp av slike integrerte systemer kan interesseposisjoner avbildes under og etter FIB-fresing for å kontrollere tilstedeværelsen av målfluorescenssignalet uten å øke risikoen for kontaminering av de endelige lamellene. Det er imidlertid viktig å huske på de optiske parametrene til de brukte mikroskopene, da for eksempel et lavt NA-mål vil begrense presisjonen som fiducial perler og målsignaler kan lokaliseres med. Ikke desto mindre vil integrerte FLM-oppsett bidra til å håndtere små deformasjoner av rutenett og lameller, da FLM-stabler kontinuerlig kan oppdateres og sammenlignes med oppdaterte SEM- og IB-visninger.
Som et alternativ til fluorescensavbildning av lamellen mellom FIB-fresing og TEM-datainnsamling, kan post-TEM-korrelasjon brukes til å verifisere riktig plassering og fresing av lamellene 5,6.
Under alle trinnene i den korrelative arbeidsflyten, men spesielt under TEM, anbefales det å lage et overlegg av de projiserte fluorescensdataene på FIB-SEM/TEM-bildene. Slike klassiske CLEM-visninger hjelper til med å forstå mer intuitivt hvilken del av cellene som finnes i lamellene. Dette fungerer også som en nyttig tilregnelighetskontroll for å verifisere nøyaktigheten av korrelasjonen.
3. Begrensninger av metoden
Den 3D-korrelative FIB-tilnærmingen krever prøver som kan leveres med fiducial perler. Følgelig er denne metoden for tiden begrenset til stupfrosne rister. For høytrykks (HPF) frosne (vev) prøver, for tiden kan bare 2D-2D korrelasjoner utføres. Potensielt kan interne fiducial markører (f.eks. organeller, fargede lipiddråper) være en løsning på dette problemet32,33. Den endelige korrelasjonssuksessraten avhenger av mange faktorer, inkludert prøvekvaliteten, fluorescensmikroskopioppsettet, lamelltykkelsen og størrelsen på den målrettede strukturen. Korrelasjonsnøyaktigheten ved hjelp av den beskrevne 3D-registreringsmetoden er estimert til å være i området 200-300 nm på det endelige IB-bildet, omtrent tilsvarende den typiske tykkelsen på FIB-fresede lameller7. Følgelig vil cellulære strukturer som er mye mindre enn dette være vanskelig å målrette for øyeblikket. I tillegg reduserer overdreven bevegelse på fresestedet (>300 nm) også nøyaktigheten av korrelasjonen, et problem som potensielt kan løses med FLM-oppsett integrert i FIB / SEM-instrumenter. Lameller som viser sterk deformasjon eller bøyning under fresing, bør uansett utelukkes fra arbeidsflyten nedstrøms.
Samlet sett er kryofluorescensavbildning for tiden begrenset av Abbe-diffraksjonskriteriet. Med mer rutinemessig anvendelse (og kommersialisering) av superoppløste kryo-FLM-metoder, kan mer nøyaktig målretting av cellulære strukturer bli mulig, spesielt når integrert i FIB / SEM for on-the-fly drift.
4. Betydningen av metoden
Spesielt i forhold til ikke-målrettede og post-korrelasjonsteknikker, tillater den 3D-korrelerte FIB-fresemetoden valg av passende posisjoner før det tid- og ressurskrevende TEM-trinnet. Det muliggjør dermed mer effektiv datainnsamling og prosjektplanlegging. Videre legger de korrelerte fluorescensdataene til et lag med informasjon som kan være avgjørende for å tolke tomogrammene og for å integrere kryo-ET-resultatene i multiskalaprosjekter, spesielt når det gjelder ikke-strukturerte proteinsamlinger eller de som er for små for malmatching og subtomogramgjennomsnitt.
5. Betydning og potensielle fremtidige applikasjoner
I kombinasjon med avanserte arbeidsflyter som kryoløft ut av HPF-prøver 34,35, cryo-FIB-SEM volum 36 og superoppløselig fluorescensavbildning26,37,38,39, gir 3D-målrettet lamellpreparering utsikter til ikke bare å dissekere biologiske prosesser i isolerte celler, men også å gjøre vevs- og pasientprøver tilgjengelige for FIB-fresing og kryo-elektrontomografi. Som sådan vil det tillate disseksjon av patologiske prosesser ved høy oppløsning og dermed være en integrert byggestein mot en biopsi på nanoskala.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Inga Wolf for støtte til IT-infrastrukturen, Florian Beck for beregningsstøtte og Oda H. Schiøtz for kritisk lesning av manuskriptet. Finansiering ble gitt delvis gjennom et Alexander von Humboldt returners fellowship til Philipp S. Erdmann og et EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014 til Florian Wilfling. Anna Bieber ble støttet av et Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. fellowship.
Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |