애기장염 씨앗의 표면 살균을 위한 높은 처리량, 견고하고 매우 시간 유연한 방법
Summary
아라비도프스탈리아나(Arabidopsis) 종자의 표면 살균을 위한 고처리량 프로토콜이 제공되어 진공 펌프로 구성된 간단한 흡입 장치로 액체 처리 단계를 최적화합니다. 수백 개의 종자 시료는 하루에 표면 살균될 수 있습니다.
Abstract
애기장염은 지금까지 기능 연구에 가장 널리 사용되는 식물 모델 종입니다. 아라비도시스 씨앗의 표면 살균은 이 쪽으로 요구되는 근본적인 단계입니다. 따라서, 고처리량 인 애비도시스 종자 표면 살균 방법을 한 번에 수십~수백 개의 시료(예: 트랜스제닉 라인, 에코타입 또는 돌연변이)를 처리하는 것이 가장 중요하다. 일반적인 진공 펌프로 구성된 수제 흡입 장치로 튜브에서 액체를 효율적으로 제거하는 종자 표면 살균 방법이 이 연구에서 제시된다. 하루에 수백 개의 샘플을 처리하는 이 방법으로 노동 집약적인 실습 시간을 획기적으로 줄임으로써 약간의 노력으로 가능합니다. 시리즈 타임코스 분석은 높은 발아율을 유지함으로써 표면 멸균의 매우 유연한 시간 범위를 더욱 나타내냈습니다. 이 방법은 종자 크기에 따라 흡입 장치의 간단한 사용자 정의와 작은 씨앗의 다른 종류의 표면 살균에 쉽게 적응 할 수있다, 액체를 제거하기 위해 원하는 속도.
Introduction
아라비도시스는 브라시카세아 족에 속하는 디플로이드 식물 종입니다. 상대적으로 짧은 수명 주기(장시간 성장 조건 하에서 세대당 2개월), 작은 식물 크기, 식물당 수백 종의 종생산과 함께 자체 수분은 최초의 기초 식물 모델 종1,2를만들었습니다. 또한, 그 게놈은완전히 서열3, 광범위한 역유전학 도구(포화 T-DNA, 트랜스포손 및 화학적으로 돌연변이된 인구)를 사용할 수 있는4,5,6,효과적인 아그로박테리움-매개변환은 추가 하류 작업을 위한 충분한 형질전환선을 확보하기 에 잘 확립되어있다7 . 따라서, 지난 2년 동안, 자연, 유전적 및 현상변이를 포함한 분자 수준에서 식물 생물학의 다양한 측면을 해부하는 모델 종으로 애기독증을 사용하여 큰 발전을 이루었다8,9.
애기장염에 대한 관심 있는 유전자를 기능적으로 특성화하기 위해, 곰팡이 및 세균 오염 물질을 제거하기 위한 종자 표면 살균은 축균 배양을 요구하는 많은 다운스트림 프로토콜을 위한 전제 조건 단계이다. 과발현(RNA-I11)또는 녹아웃(12,13)유전자 기능, 세포외 국소화14,프로모터활동(15,16,단백질-단백질17 및 단백질-DNA 상호작용18)에대한 유전적 변형은 종자 표면 멸균 단계를 모두 필요로 한다. 따라서, 상대적 단순함에도 불구하고, 종자 표면 살균은 많은 기능 적 분석에서 근본적인 역할을한다.
지금까지, 종자 표면 살균 방법의 두 가지 주요 범주는 가스 또는 액체 상멸균(19)에기초하여 개발되었다. 가스상 종자 표면 살균의 처리량은 중간에서 높지만, 유해 시약 염소 가스를 표면 살균 제로로 사용하여 광범위한 적용을 방해하고 있습니다. 반대로 액체 상 살균을 기반으로 하는 방법은 표면 살균을 위해 에탄올 및 표백제 솔루션과 같은 온화한 화학 물질에 의존하며, 염소 훈증보다 본질적으로 낮은 처리량이 있음에도 불구하고 더 널리 사용됩니다. 일반적으로 액체 시약을 사용하는 두 가지 방법이 일반적으로 사용됩니다. 크게 사용되는 방법은20,21의다른 지속 시간 동안 다른 농도에서 에탄올과 표백제로 세척을 기반으로합니다. 또 다른 방법은 표백제만21,22의적용을기반으로 한다. 두 방법 모두 주로 소규모 종자 표면 살균을 위해 적용됩니다. 그러나, 많은 실험에서, 다른변형(24, 25)으로부터생성된 많은 형질대사를 병렬로 하나의변형(15,23) 또는 스크린에서 파생된 많은 애비독시스 형질대사를 스크리징할 필요가있다. 우리의 지식에, 높은 처리량 종자 표면 살균을 위한 액체 기지를 둔 방법이 간행되지 않았습니다, 이는, 거의 인식하더라도, 기능적인 유전체학 접근을 위한 중요한 병목 현상을 구성합니다. 따라서 종자 표면 살균을 위한 안전하고 견고하며 높은 처리량 방법을 개발하는 것은 한 번에 많은 유전자의 기능적 특성화의 성공을 향한 필요하고 중요한 단계이다.
이를 위해, 현재 연구에서는, 아라비도시스 씨앗의 표면 살균을 위한 향상된 방법이 제시된다. 이 방법은 안전하고 저렴한 비용, 고도로 견고하며 처리량이 높으며, 종자 표면 살균 초기부터 페트리 접시의 종자 파종 끝까지 1시간 이내에 96개의 독립적인 라인을 처리할 수 있습니다. 입증 된 방법은 진공 펌프, 소모품 유리 제품 및 플라스틱 제품과 같은 널리 사용되는 기본 실험실 계측에 의존합니다. 이 개선된 방법은 과학 계에 아라비도시스 및 기타 비모델 식물 종의 현대 기능 적 유전체학 접근법에 적합한 처리량으로 종자 표면 살균을 간소화하는 안전하고 간단하며 저렴한 접근 방식을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
씨앗의 살균은 애기독증의 기능 적 연구를위한 기본 단계입니다. 그것은 자주 많은 다른 목적을 위해 수행 되지만, 애비도시스에서 높은 처리량 종자 표면 살균에 제한 된 연구를 사용할 수 있습니다.
지금까지, 가장 높은 처리량을 가진 방법 중 하나는 농축 된 HCl과 표백제혼합에 의해 생성 된 염소 가스를 사용하는 것입니다. 이 방법은 제한된 실습 시간을 필요로하지만, 그?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 폰다지오네 E. 마하의 에코게노믹스 그룹의 핵심 자금을 통해 트렌토 자치구에 의해 지원되었다.
Materials
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
Referências
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al. Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae. BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
