एकल-नाभिक आरएनए-अनुक्रमण के लिए वयस्क माउस किडनी से नाभिक अलगाव
Summary
यहां, हम जमे हुए माउस गुर्दे से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो मज्जा किडनी सेल प्रकारों के प्रतिनिधित्व में सुधार करता है और एंजाइमेटिक ऊतक पृथक्करण से जीन अभिव्यक्ति कलाकृतियों से बचता है।
Abstract
गुर्दे पानी, इलेक्ट्रोलाइट और एसिड-बेस होमियोस्टैसिस जैसी विविध जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं। गुर्दे के शारीरिक कार्यों को अंग के कॉर्टिकोमेडुलरी अक्ष पर एक जटिल वास्तुकला में व्यवस्थित कई सेल प्रकारों द्वारा निष्पादित किया जाता है। एकल-कोशिका ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स में हालिया प्रगति ने गुर्दे के शरीर विज्ञान और बीमारी में सेल प्रकार-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति की समझ को तेज कर दिया है। हालांकि, एंजाइम-आधारित ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल, जो अक्सर एकल-कोशिका आरएनए-अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) के लिए उपयोग किए जाते हैं, को ज्यादातर ताजा (गैर-संग्रहीत) ऊतक की आवश्यकता होती है, ट्रांसक्रिप्शनल तनाव प्रतिक्रियाओं को पेश करते हैं, और किडनी कॉर्टेक्स के प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों के चयन का पक्ष लेते हैं, जिसके परिणामस्वरूप मज्जा की कोशिकाओं का कम प्रतिनिधित्व होता है।
यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो इन समस्याओं से बचता है। प्रोटोकॉल जमे हुए गुर्दे के ऊतकों से 4 डिग्री सेल्सियस पर नाभिक अलगाव पर आधारित है। नाभिक को माउस किडनी के एक केंद्रीय टुकड़े से अलग किया जाता है जिसमें कॉर्टेक्स, बाहरी मज्जा और आंतरिक मज्जा शामिल होते हैं। यह मज्जा कोशिकाओं के लाभ के लिए पूरे गुर्दे के नमूनों के लिए विशिष्ट कॉर्टिकल कोशिकाओं के अतिप्रतिनिधित्व को कम करता है जैसे कि डेटा पर्याप्त प्रचुरता में पूरे कॉर्टिकोमेडुलरी अक्ष का प्रतिनिधित्व करेगा। प्रोटोकॉल सरल, तेज और अनुकूलनीय है और गुर्दे के अनुसंधान में एकल-नाभिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स के मानकीकरण की दिशा में एक कदम प्रदान करता है।
Introduction
गुर्दे एक अत्यधिक जटिल ऊतक वास्तुकला प्रदर्शित करते हैं। वे एक कॉर्टिकोमेडुलरी अक्ष के साथ कार्यात्मक और शारीरिक रूप से अलग-अलग खंडों से मिलकर बनते हैं और जैविक कार्यों को मध्यस्थ करते हैं, जैसे कि बाह्य तरल पदार्थ की मात्रा, इलेक्ट्रोलाइट संतुलन, या एसिड-बेस होमियोस्टेसिस1 का विनियमन।
एकल-कोशिका ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स में प्रगति ने जटिल ऊतकों के गहन लक्षण वर्णन को सक्षम किया है और गुर्दे के शरीर विज्ञान, विकास और रोग 2,3,4 में खंड और सेल प्रकार-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति की समझ को तेज किया है।
हालांकि, एंजाइम-आधारित पृथक्करण प्रोटोकॉल जो अक्सर एससीआरएनए-सेक के लिए उपयोग किए जाते हैं, कई कमियां और बाधाएं प्रदर्शित करते हैं। प्रोटोकॉल के आधार पर, वे ट्रांसक्रिप्शनल तनाव प्रतिक्रियाओं और ऊतक पृथक्करण पूर्वाग्रह को आसानी से अलग करने वाले कॉर्टिकल सेल प्रकार 5,6 के प्रति उत्पन्न करते हैं। यद्यपि भ्रूण के गुर्दे के लिए कोल्ड-एक्टिव प्रोटीज का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल तनाव से संबंधित ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों को कम करने में सक्षम हैं, वे कॉर्टिकल कोशिकाओं के प्रति पृथक्करण पूर्वाग्रह को दूर करने में विफल रहते हैं और विभिन्न प्रकार के रोगग्रस्त गुर्दे के ऊतकों के लिए आसानी से अनुकूलनीय नहीं होसकते हैं। इसके अलावा, एकल-कोशिका दृष्टिकोण जमे हुए ऊतक नमूनों के साथ आसानी से संगत नहीं होते हैं, उनके आवेदन को ज्यादातर गैर-संग्रहीत, ताजा ऊतक तक सीमित करते हैं, इस प्रकार ऊतक संग्रह को एक प्रतिबंधित कारकबनाते हैं।
एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण (एसएनआरएनए-सेक) इन सीमाओं8,9 को दरकिनार कर सकता है। यहां, हम जमे हुए वयस्क माउस किडनी ऊतक (चित्रा 1)10) के एक केंद्रीय टुकड़े से नाभिक अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हमारा प्रोटोकॉल सरल है और प्रयोगात्मक मॉडल के लिए विभिन्न किडनी सेल प्रकारों के संतुलित प्रतिनिधित्व के साथ आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों को प्राप्त करने के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसमें मजबूत क्षेत्रीय ऊतक परिवर्तन शामिल नहीं हैं। बाद के मामले में, हमारे प्रोटोकॉल को पूरे गुर्दे के साथ भी किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सिंगल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स गुर्दे के शरीर विज्ञान और बीमारी में सेल प्रकार-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति की समझ को आगे बढ़ाते हैं। यहां, हमने एक मानकीकृत तरीके से एसएनआरएनए-सेक के लिए जमे हुए माउस किडनी ऊतक से उच्च गुणवत्ता वाले एकल नाभिक को अलग करने के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान की।
एसएनआरएनए-सेक के लिए, पुस्तकालय उत्पादन के लिए इनपुट के रूप में उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक का उपयोग करना और ऊतक प्रसंस्करण के दौरान आरएनए क्षरण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, विच्छेदन के तुरंत बाद आरएनए स्थिरीकरण समाधान में ऊतक के टुकड़ों का इनक्यूबेशन सेलुलर आरएनए की रक्षा और स्थिर करने के लिए आवश्यक है और अनिश्चित काल तक – 80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल को आरएनए स्थिरीकरण समाधान उपचार के बिना जमे हुए ऊतक पर लागू करते समय, जैसे अभिलेखीय सामग्री, एक परीक्षण रन की आवश्यकता होती है, और आरएनए गुणवत्ता का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है क्योंकि हमने आरएनए स्थिरीकरण समाधान में पूर्व इनक्यूबेशन के बिना स्नैप-जमे हुए ऊतक में आरएनए अखंडता का एक महत्वपूर्ण नुकसान देखा।
सामान्य तौर पर, बरकरार, एकल नाभिक की वसूली को अधिकतम करने के लिए उचित नमूना हैंडलिंग महत्वपूर्ण है। कतरनी तनाव और शारीरिक क्षति से बचने के लिए सभी पुन: निलंबन चरणों को सावधानीपूर्वक पाइपिंग द्वारा किया जाना चाहिए। अंतिम नाभिक पुन: निलंबन और नाभिक छंटाई के लिए बफर में नाभिक हानि और एकत्रीकरण से बचने के लिए बीएसए होना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल में बफर वॉल्यूम बहुत छोटे ऊतक नमूने (~ 15 मिलीग्राम) के लिए अनुकूलित हैं। उच्च गुणवत्ता वाले निलंबन उत्पन्न करने के लिए पूर्ण सेल लाइसिस और पर्याप्त धुलाई सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। बड़े ऊतक ब्लॉक या पूरे गुर्दे के नमूने के परिणामस्वरूप अत्यधिक नाभिक सांद्रता होगी जो झुरमुट और एकत्रीकरण, परिवेश आरएनए की उच्च प्रचुरता और समग्र खराब निलंबन गुणवत्ता का कारण बनती है। यदि बड़े नमूने या अन्य ऊतक संसाधित किए जाते हैं, तो न्यूनतम परिवेश आरएनए स्तरों के लिए इष्टतम बफर वॉल्यूम निर्धारित करने के लिए परीक्षण रन करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। नाभिक और आरएनए गुणवत्ता और सांद्रता की सावधानीपूर्वक जांच करने की आवश्यकता है क्योंकि ओवरलोडिंग के परिणामस्वरूप समग्र खराब प्रदर्शन होता है।
इसके अलावा, बड़ी मात्रा में सेल मलबे, जिससे परिवेश आरएनए के उच्च स्तर एकल नाभिक से जुड़े नहीं होते हैं, अनुक्रमण परिणामों को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं। सुक्रोज कुशन के माध्यम से सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा नाभिक निलंबन का स्पष्टीकरण कुछ हद तक इस समस्या को कम करता है, लेकिन यह प्रतिरक्षा कोशिकाओं में मौजूद घने, छोटे नाभिक के खिलाफ काउंटर चयन करके सेल प्रकार के प्रतिनिधित्व में पूर्वाग्रह भी पैदा करसकता है। यदि यह चिंता का विषय है, तो सुक्रोज ढाल को छोड़ दिया जाना चाहिए। इसके विपरीत, हमने पाया कि डीएपीआई धुंधला होने पर आधारित फ्लो साइटोमेट्री उच्च गुणवत्ता वाले एकल नाभिक निलंबन का उत्पादन करने के लिए सेल मलबे की मात्रा को कम करने के लिए महत्वपूर्ण थी।
एकल-कोशिका दृष्टिकोण 8 की तुलना में एकल नाभिक के अलगाव के काफी फायदेहैं। यह ठीक से जमे हुए ऊतक के साथ संगत है, ऊतक संग्रह को अधिक लचीला बनाता है, और एंजाइम-आधारित ऊतक पृथक्करण की आवश्यकता को दरकिनार करता है, जो ट्रांसक्रिप्शनल तनाव प्रतिक्रियाओं को पेश कर सकता है 6,17. इसके अलावा, यह पृथक्करण पूर्वाग्रह को दूर करता है जो गुर्दे के कॉर्टेक्स के आसानी से अलग होने योग्य सेल प्रकारों के चयन का पक्ष लेता है, जिससे कुछ एंजाइम-आधारितदृष्टिकोणों 5,6,10 में मज्जा सेल प्रकारों का कम प्रतिनिधित्व हो सकता है।
पूरे गुर्दे के ऊतकों के बजाय एक केंद्रीय गुर्दे के टुकड़े का उपयोग करना संसाधनों को बचाता है और प्रचुर मात्रा में सेल प्रकारों के अतिप्रतिनिधित्व के लिए सही करता है जैसा कि पहलेवर्णित है। हालांकि, माउस मॉडल या फेनोटाइप की जांच के आधार पर, एक मध्य स्लाइस के बजाय पूरे गुर्दे के नमूने का उपयोग करना फायदेमंद हो सकता है। पूरे गुर्दे के नमूने सच्चे सेल अनुपात, या पूरे गुर्दे में होने वाले परिवर्तनों का अधिक प्रतिनिधि हो सकते हैं, जबकि एक छंटनी मध्य टुकड़ा मज्जा फेनोटाइप के लिए फायदेमंद साबित हुआ या जब नमूना सामग्री सीमित थी। इसलिए, यह निर्णय अत्यधिक उपयोगकर्ता-विशिष्ट है और इसे सावधानीपूर्वक माना जाना चाहिए।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए हेल्महोल्ट्ज़ एसोसिएशन, बर्लिन में मैक्स डेलब्रुक सेंटर फॉर मॉलिक्यूलर मेडिसिन में वैज्ञानिक जीनोमिक्स प्लेटफॉर्म को धन्यवाद देते हैं।
जेएल और केएमएसओ को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) रिसर्च ट्रेनिंग ग्रुप जीआरके 2318 और रिसर्च यूनिट फॉर 2841 द्वारा समर्थित किया गया था। केएमएसओ को सहयोगी अनुसंधान अनुदान 1365 द्वारा समर्थित किया गया था। एबी को एनआर को दिए गए डीएफजी के गॉटफ्रीड विल्हेम लीबनिज़ पुरस्कार से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Cell sorter | – | – | For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000015 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope. |
| 4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) | Biotrend | 40043/b | Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM. |
| D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free | VWR | 0335-500G | |
| DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22431021 | |
| Ethanol, 70 % | – | – | |
| FACS tubes | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma-Aldrich | D8938-1SET | |
| Minisart Syringe Filters 0.2 µm | Sartorius | 16534-GUK | |
| Nuclease-free Water | Invitrogen | AM9937 | |
| Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit | Sigma-Aldrich | NUC-101 | Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation. |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Petri dishes, polystyrene 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| pluriStrainer Mini 100 µm | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| pluriStrainer Mini 20 µm | pluriSelect | 43-10020-40 | |
| pluriStrainer Mini 40 µm | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL) | Falcon | 352099 | |
| Razor blades | – | – | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | EO0384 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C. |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | |
| RNase AWAY | Fisher Scientific | 11952385 |
Referências
- Thomas, R. S. Kidney modeling and systems physiology. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 1 (2), 172-190 (2009).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Park, J., Liu, C. L., Kim, J., Susztak, K. Understanding the kidney one cell at a time. Kidney International. 96 (4), 862-870 (2019).
- Clark, A. R., Greka, A. The power of one: advances in single-cell genomics in the kidney. Nature Reviews Nephrology. 16 (2), 73-74 (2020).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Muto, Y., et al. Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney. Nature Communications. 12 (1), 2190 (2021).
- Hinze, C., et al. Kidney single-cell transcriptomes predict spatial corticomedullary gene expression and tissue osmolality gradients. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (2), 291 (2021).
- Berger, S. L. Isolation of cytoplasmic RNA: ribonucleoside-vanadyl complexes. Methods in Enzymology. 152, 227-234 (1987).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease. Science. 360 (6390), 758-763 (2018).
- Kirita, Y., Wu, H., Uchimura, K., Wilson, P. C., Humphreys, B. D. Cell profiling of mouse acute kidney injury reveals conserved cellular responses to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15874-15883 (2020).
- Schneeberger, S., et al. The neuroinflammatory interleukin-12 signaling pathway drives Alzheimer’s disease-like pathology by perturbing oligodendrocyte survival and neuronal homeostasis. bioRxiv. , 441313 (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
