Medindo flux de substrato mitocondrial em células o-permeabilizadas de permeabilized recombinante

Resumo

Neste trabalho, descrevemos um protocolo modificado para testar o flux de substrato respiratório mitocondrial usando perfringolysina recombinante O em combinação com respirometria à base de microplato. Com este protocolo, mostramos como a metformina afeta a respiração mitocondrial de duas linhas diferentes de células tumorais.

Resumo

O flux de substrato mitocondrial é uma característica distintiva de cada tipo de célula, e mudanças em seus componentes como transportadores, canais ou enzimas estão envolvidas na patogênese de várias doenças. Flux de substrato mitocondrial pode ser estudado usando células intactas, células permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas. Investigar células intactas encontra vários problemas devido à oxidação simultânea de diferentes substratos. Além disso, vários tipos de células contêm lojas internas de diferentes substratos que complicam a interpretação dos resultados. Métodos como isolamento mitocondrial ou uso de agentes permeabilizantes não são facilmente reprodutíveis. Isolar mitocôndrias puras com membranas intactas em quantidades suficientes de pequenas amostras é problemático. O uso de permeabilizers não seletivos causa vários graus de danos inevitáveis da membrana mitocondrial. A perfringolysina recombinante O (rPFO) foi oferecida como um permeabilizer mais apropriado, graças à sua capacidade de permeabilize seletivamente a membrana plasmática sem afetar a integridade mitocondrial. Quando usado em combinação com respirometria de microplaco, permite testar o fluxo de vários substratos mitocondriais com réplicas suficientes dentro de um experimento enquanto usa um número mínimo de células. Neste trabalho, o protocolo descreve um método para comparar o flux de substrato mitocondrial de dois fenótipos ou genótipos celulares diferentes e pode ser personalizado para testar vários substratos mitocondriais ou inibidores.

Introdução

A respirometria baseada em microplacar revolucionou a pesquisa mitocondrial, permitindo o estudo da respiração celular de um pequeno tamanho amostral¹. A respiração celular é geralmente considerada como um indicador de função mitocondrial ou "disfunção", apesar do fato de que a gama mitocondrial de funções se estende além da produção de energia². Em condições aeróbicas, as mitocôndrias extraem a energia armazenada em diferentes substratos, quebrando e convertendo esses substratos em intermediários metabólicos que podem alimentar o ciclo do ácido cítrico³ (Figura 1). O....

Protocolo

1. Um dia antes do ensaio

1. Preparação de reagentes e substratos.
   1. Solução de ensaio mitocondrial (MAS): Prepare soluções de estoque de todos os reagentes descritos na Tabela 1. Aqueça os estoques de manitol e sacarose a 37 °C para dissolver completamente. Misture os reagentes para preparar 2x MAS e aqueça a mistura a 37 °C. Ajuste o pH com 5N KOH para 7,4 (~7 mL), depois adicione água para levar o volume até 1 L. Estérilize o filtro e armazene as alíquotas a -20 °C até o dia da medição.
   2. Albumina de soro bovino (5% BSA): Dissolver 5 g de BSA em 90 mL de água estéril pré-armada em um agitador magnético e evitar tremer. Ajuste....

Resultados

Comece pela normalização dos resultados para a segunda medição da respiração da linha de base para mostrar valores como percentual de taxa de consumo de oxigênio (OCR%). Os resultados do ensaio são mostrados nas Figuras 5,Figura 6,Figura 7 e Figura 8. É importante atribuir os poços de fundo adequados para cada grupo e inativar os poços de fundo de outros grupos.

Discussão

Este protocolo é uma modificação dos estudos publicados anteriormente^7,8,9,10 e o guia do usuário do produto. Em contraste com o protocolo do fabricante, o 2x MAS é usado em vez de 3x MAS, uma vez que 2× MAS é mais fácil de dissolver e não forma precipitações após o congelamento. Alíquotas MAS 2x congeladas podem ser armazenadas até seis meses e mostrar resultados consistentes. Outra diferença .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Adenosina 5′ -difosfato monopotássio sal di-hidratado	Merck	A5285	armazenar a -20 &graus; C
Antimicina A	Merck	A8674	loja a -20 ° C
Albumina de soro bovino	Merck	A3803	armazenar em 2 - 8 ° C
Cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona	Merck	C2920	loja a -20 &graus; C
Dimetilsulfóxido Merck		D8418	loja em RT
D-Manitol	Merck	63559	loja em RT
Solução salina tamponada com fosfato	de Dulbecco Gibco	14190-144	loja em RT
Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético	Merck	03777	loja em RT
HEPES	Merck	H7523	loja na RT
L (-) sal dissódico de ácido málico	Merck	M9138	loja na RT
Hidrato de sal de sódio de ácido L-glutâmico	Merck	G5889	loja na RT
Cloreto de magnésio hexahidratado	Merck	M2670	loja na RT
Oligomicina	Merck	O4876	loja em -20 ° C
Cloreto de palmitoil-DL-carnitina	Merck	P4509	armazenar a -20 ° C
Hidróxido de potássio	Merck	484016	loja em RT
Fosfato de potássio monobásico	Merck	P5655	loja em RT
Rotenona	Merck	R8875	loja em -20 ° C
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Download from www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent technologies	102416-100	XFe96 cartuchos de sensor e microplacas de cultura de células XF96
Piruvato de sódio	Merck	P2256	armazenar em 2 - 8 ° C
Succinato de sódio dibásico hexahidratado	Merck	S2378	loja na RT
Sacarose	Merck	S7903	loja na RT
Água	Merck	W3500	loja na RT
XF calibrante	Agilent technologies	100840-000	loja na RT
XF Permeabilizador de membrana plasmática	Agilent technologies	102504-100	Perfringolisina O recombinante (rPFO) - Alíquota e armazenar a -20 ° O