Meten van mitochondriale substraatflux in recombinante perfringolysine O-permeabiliseerde cellen
Summary
In dit werk beschrijven we een aangepast protocol om mitochondriale respiratoire substraatflux te testen met behulp van recombinant perfringolysine O in combinatie met respirometrie op basis van microplaten. Met dit protocol laten we zien hoe metformine de mitochondriale ademhaling van twee verschillende tumorcellijnen beïnvloedt.
Abstract
Mitochondriale substraatflux is een onderscheidend kenmerk van elk celtype en veranderingen in de componenten ervan, zoals transporters, kanalen of enzymen, zijn betrokken bij de pathogenese van verschillende ziekten. Mitochondriale substraatflux kan worden bestudeerd met behulp van intacte cellen, gepermeabiliseerde cellen of geïsoleerde mitochondriën. Het onderzoeken van intacte cellen stuit op verschillende problemen als gevolg van gelijktijdige oxidatie van verschillende substraten. Bovendien bevatten verschillende celtypen interne opslagplaatsen van verschillende substraten die de interpretatie van resultaten bemoeilijken. Methoden zoals mitochondriale isolatie of het gebruik van permeabiliseermiddelen zijn niet gemakkelijk reproduceerbaar. Het isoleren van zuivere mitochondriën met intacte membranen in voldoende hoeveelheden uit kleine monsters is problematisch. Het gebruik van niet-selectieve permeabilizers veroorzaakt verschillende gradaties van onvermijdelijke mitochondriale membraanschade. Recombinant perfringolysine O (rPFO) werd aangeboden als een meer geschikte permeabilisator, dankzij het vermogen om selectief het plasmamembraan te permeabiliseren zonder de mitochondriale integriteit te beïnvloeden. Bij gebruik in combinatie met microplaat respirometrie maakt het het mogelijk om de flux van verschillende mitochondriale substraten te testen met voldoende replicaties binnen één experiment terwijl een minimaal aantal cellen wordt gebruikt. In dit werk beschrijft het protocol een methode om mitochondriale substraatflux van twee verschillende cellulaire fenotypes of genotypen te vergelijken en kan worden aangepast om verschillende mitochondriale substraten of remmers te testen.
Introduction
Microplate-gebaseerde respirometrie heeft een revolutie teweeggebracht in mitochondriaal onderzoek door de studie van cellulaire ademhaling van een kleine steekproefgrootte mogelijk te maken1. Cellulaire ademhaling wordt over het algemeen beschouwd als een indicator van mitochondriale functie of ‘disfunctie’, ondanks het feit dat het mitochondriale scala aan functies verder reikt danenergieproductie 2. In aerobe omstandigheden extraheren mitochondriën de energie die is opgeslagen in verschillende substraten door deze substraten af te breken en om te zetten in metabole tussenproducten die de citroenzuurcyclus kunnen voeden3 (Figuur 1). De continue flux van substraten is essentieel voor de stroom van de citroenzuurcyclus om hoogenergetische ‘elektronendonoren’ te genereren, die elektronen leveren aan de elektronentransportketen die een protongradiënt over het binnenste mitochondriale membraan genereert, waardoor ATP-synthase ADP tot ATP kan fosforyleren4. Daarom moet een experimenteel ontwerp om mitochondriale ademhaling te testen de monsternatuur (intacte cellen, gepermeabiliseerde cellen of geïsoleerde mitochondriën) en mitochondriale substraten omvatten.
Cellen houden een opslag van inheemse substraten5, en mitochondriën oxideren verschillende soorten substraten tegelijkertijd6, wat de interpretatie van resultaten verkregen uit experimenten uitgevoerd op intacte cellen bemoeilijkt. Een veel voorkomende aanpak om mitochondriaal vermogen om een geselecteerd substraat te oxideren te onderzoeken, is om mitochondriën te isoleren of de onderzochte cellen te permeabiliseren5. Hoewel geïsoleerde mitochondriën ideaal zijn voor kwantitatieve studies, is het isolatieproces arbeidsintensief. Het wordt geconfronteerd met technische problemen zoals de noodzaak van een grote steekproefomvang, zuiverheid van de opbrengst en reproduceerbaarheid van de techniek5. Gepermeabiliseerde cellen bieden een oplossing voor de nadelen van mitochondriale isolatie; routinematige permeabiliseermiddelen van detergent aard zijn echter niet specifiek en kunnen mitochondriale membranen beschadigen5.
Recombinant perfringolysine O (rPFO) werd aangeboden als een selectief plasmamembraanpermeabiliserend middel7en werd met succes gebruikt in combinatie met een extracellulaire fluxanalysator in verschillende studies7,8,9,10. We hebben een protocol aangepast met behulp van rPFO om mitochondriale substraatflux te screenen met behulp van XFe96 extracellulaire fluxanalysator. In dit protocol worden vier verschillende substraatoxiderende routes in twee cellulaire fenotypen vergeleken met voldoende replicaties en de juiste controle voor elk getest materiaal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is een wijziging van eerder gepubliceerde studies7,8,9,10 en de gebruikershandleiding van het product. In tegenstelling tot het protocol van de fabrikant wordt 2x MAS gebruikt in plaats van 3x MAS, omdat 2× MAS gemakkelijker op te lossen is en geen neerslag vormt na bevriezing. Bevroren 2x MAS aliquots kunnen tot zes maanden worden bewaard en laten consistente resultaten zien. Een…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de medewerkers van de afdeling Fysiologie van de faculteit Geneeskunde in Hradec Králové en de afdeling Pathofysiologie van de Derde Faculteit Geneeskunde voor de hulp bij de voorbereiding van chemicaliën en monsters. Dit werk werd ondersteund door Charles University subsidieprogramma’s PROGRES Q40/02, Tsjechische ministerie van Volksgezondheid subsidie NU21-01-00259, Tsjechische wetenschap stichting subsidie 18-10144 en INOMED project CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 gefinancierd door het ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport van de Tsjechische Republiek en door de Europese Unie.
Materials
| Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |
Referências
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
