재조합 퍼프렌고리신 O-퍼메아빌화 세포에서 미토콘드리아 기질 플럭스 측정
Summary
이 작품에서는, 우리는 마이크로 플레이트 기지를 둔 호흡측정과 조합하여 재조합 퍼프렌고리신 O를 사용하여 미토콘드리아 호흡 기질 플럭스를 시험하기 위하여 수정된 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜을 통해 메트포르민이 두 개의 다른 종양 세포주의 미토콘드리아 호흡에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다.
Abstract
미토콘드리아 기질 플럭스는 각 세포 유형의 구별되는 특성이며, 수송기, 채널 또는 효소와 같은 성분의 변화는 여러 질병의 발병기전에 관여한다. 미토콘드리아 기질 플루는 그대로 세포, 과밀 세포 또는 분리된 미토콘드리아를 사용하여 연구될 수 있다. 그대로 세포를 조사하는 것은 다른 기판의 동시 산화로 인해 여러 가지 문제가 발생합니다. 게다가, 몇몇 세포 모형은 결과 해석을 복잡하게 하는 다른 기판의 내부 상점을 포함합니다. 미토콘드리아 절연 또는 투과성 제제를 사용하는 것과 같은 방법은 쉽게 재현할 수 없습니다. 작은 견본에서 충분한 양에 있는 그대로 막으로 순수한 미토콘드리아를 격리하는 것은 문제가 됩니다. 비선택적 과미빌라이저를 사용하면 피할 수 없는 미토콘드리아 막 손상의 다양한 정도를 유발합니다. 재조합 퍼프렌고리신 O(rPFO)는 미토콘드리아 무결성에 영향을 미치지 않으면서 플라즈마 멤브레인을 선택적으로 투과화할 수 있는 능력 덕분에 보다 적절한 퍼미알로이저로 제공되었다. 마이크로 플레이트 호흡측정기와 함께 사용하면 최소한의 수의 세포를 사용하는 동안 한 실험 내에서 충분한 복제로 여러 미토콘드리아 기판의 플럭스를 테스트할 수 있습니다. 본 작품에서, 프로토콜은 2개의 상이한 세포 표현형 또는 유전자형의 미토콘드리아 기질 플럭스를 비교하고 각종 미토콘드리아 기판 또는 억제제를 시험하기 위하여 사용자 정의될 수 있는 방법을 기술합니다.
Introduction
마이크로플레이트 계 호흡학은 작은 샘플 크기1의세포 호흡 연구를 가능하게 함으로써 미토콘드리아 연구에 혁명을 일으켰습니다. 세포 호흡은 일반적으로 미토콘드리아 기능 또는 ‘기능 장애’의 지표로 간주됩니다, 기능의 미토콘드리아 범위가 에너지 생산을 넘어 확장한다는 사실에도 불구하고2. 호기성 조건에서, 미토콘드리아는 구연산 주기3(도 1)에연료를 공급할 수 있는 대사 중간체로 이러한 기판을 분해하고 변환하여 상이한 기판에 저장된 에너지를 추출한다. 기판의 연속 플럭스는 구연산 주기의 흐름에 필수적으로 높은 에너지 ‘전자 기증자’를 생성하여 전자를 전자 수송 사슬로 전달하여 내부 미토콘드리아 멤브레인을 가로질러 양성자 그라데이션을 생성하여 ATP-synthase를 ATP4로인계할 수 있게 한다. 따라서 미토콘드리아 호흡을 분석하는 실험적 설계에는 시료 특성(그대로 세포, 과구세포 또는 분리된 미토콘드리아) 및 미토콘드리아 기판을 포함해야 한다.
세포는 토착 기판5의저장을 유지하고, 미토콘드리아는 여러 종류의 기판을 동시에산화6,이는 그대로 세포에 수행 된 실험에서 얻은 결과의 해석을 복잡하게. 선택된 기판을 산화시키는 미토콘드리아 능력을 조사하는 일반적인 접근법은 미토콘드리아를 분리하거나 조사된 세포를 과미로 하는것이다 5. 고립 된 미토콘드리아는 정량적 연구에 이상적이지만 격리 과정은 힘들다. 큰 시료 크기, 수율의 순도 및 기술5의재현성 등의 기술적 어려움에 직면해 있다. 과미성세포는 미토콘드리아 절연의 단점에 대한 용액을 제공한다; 그러나, 세제 성질의 일상적인 충고제는 특이하지 않으며 미토콘드리아 막5를손상시킬 수 있다.
재조합 퍼프렌고리신 O(rPFO)는 선택적 혈장 막 과미경화제7으로제공되었고, 여러 연구에서 세포외 플럭스 분석기와 함께 성공적으로 사용되었다7,8,9,10. XFe96 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 미토콘드리아 기질 플럭스를 검사하기 위해 rPFO를 사용하여 프로토콜을 수정했습니다. 이 프로토콜에서, 2개의 세포 표현형에 있는 4개의 다른 기질 산화 통로는 충분한 복제및 각 시험된 물질에 대한 적당한 통제를 가진 동안 비교됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 이전에 게시된 연구7,8,9,10 및 제품 사용자 가이드를 수정한 것입니다. 제조업체의 프로토콜과 달리 2x MAS는 2× MAS가 용해하기 쉽고 동결 후 강수량을 형성하지 않기 때문에 3배 MAS 대신 사용됩니다. 냉동 2x MAS 별칭은 최대 6개월까지 저장하여 일관된 결과를 보여줄 수 있습니다. 또 다른 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 흐라데크 크랄로베의 의학 학부의 생리학과 직원과 화학 물질 및 샘플 준비에 대한 도움을 위한 제 3 학부의 병리학학과에 감사드립니다. 이 작품은 찰스 대학 교부 금교 프로그램 PROGRES Q40/02, 체코 보건부 보조금 NU21-01-00259, 체코 과학 재단 교부 18-10144 및 INOMED 프로젝트 CZ.02.1.01/0.01/0.0/0/0/18_069/0010046 교육부, 청소년 및 유럽 연합 (EU)의 유럽 연합 (EU)에 의해 지원되었다.
Materials
| Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |
Referências
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- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
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- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
