Måling av mitokondrie substrat flux i rekombinante perfringolysin O-permeabiliserte celler

Summary

I dette arbeidet beskriver vi en modifisert protokoll for å teste mitokondrie substratfluks ved hjelp av rekombinant perfringolysin O i kombinasjon med mikroplatebasert respirometri. Med denne protokollen viser vi hvordan metformin påvirker mitokondrie respirasjon av to forskjellige tumorcellelinjer.

Abstract

Mitokondrie substratflux er en kjennetegn ved hver celletype, og endringer i komponentene som transportører, kanaler eller enzymer er involvert i patogenesen av flere sykdommer. Mitokondrie substrat flux kan studeres ved hjelp av intakte celler, permeabiliserte celler eller isolert mitokondrier. Undersøkelse av intakte celler støter på flere problemer på grunn av samtidig oksidasjon av forskjellige substrater. Dessuten inneholder flere celletyper interne lagre av forskjellige substrater som kompliserer resultattolkning. Metoder som mitokondrieisolasjon eller bruk av permeabiliserende midler er ikke lett reproduserbare. Det er problematisk å isolere rene mitokondrier med intakte membraner i tilstrekkelige mengder fra små prøver. Bruk av ikke-selektive permeabilisatorer forårsaker ulike grader av uunngåelig mitokondriemembranskade. Rekombinant perfringolysin O (rPFO) ble tilbudt som en mer passende permeabilizer, takket være dens evne til selektivt å permeabilisere plasmamembran uten å påvirke mitokondrieintegriteten. Når det brukes i kombinasjon med mikroplate respirometri, tillater det å teste fluxen til flere mitokondrie substrater med nok replikeringer i ett eksperiment mens du bruker et minimalt antall celler. I dette arbeidet beskriver protokollen en metode for å sammenligne mitokondrie substratfluks av to forskjellige cellulære fenotyper eller genotyper og kan tilpasses for å teste ulike mitokondrie substrater eller inhibitorer.

Introduction

Mikroplatebasert respirometri har revolusjonert mitokondrieforskning ved å muliggjøre studiet av cellulær respirasjon av en liten prøvestørrelse¹. Cellulær respirasjon betraktes generelt som en indikator på mitokondriefunksjon eller ‘dysfunksjon’, til tross for at mitokondrieområdet av funksjoner strekker seg utover energiproduksjonen². Under aerobe forhold trekker mitokondrier ut energien som er lagret i forskjellige substrater ved å bryte ned og konvertere disse substratene til metabolske mellomprodukter som kan drive sitronsyresyklusen³ (figur 1). Den kontinuerlige strømmen av substrater er avgjørende for strømmen av sitronsyresyklusen for å generere høyenergi “elektrondonorer”, som leverer elektroner til elektrontransportkjeden som genererer en protongradient over den indre mitokondriemembranen, slik at ATP-syntase kan fosforylere ADP til ATP⁴. Derfor må en eksperimentell design for å analyse mitokondrie respirasjon inkludere prøven natur (intakte celler, permeabiliserte celler, eller isolerte mitokondrier) og mitokondrie substrater.

Celler holder en butikk med innfødte substrater⁵, og mitokondrier oksiderer flere typer substrater samtidig⁶, noe som kompliserer tolkningen av resultater oppnådd fra eksperimenter utført på intakte celler. En vanlig tilnærming for å undersøke mitokondrie evne til å oksidere et valgt substrat er å isolere mitokondrier eller permeabilisere de undersøkte cellene⁵. Selv om isolerte mitokondrier er ideelle for kvantitative studier, er isolasjonsprosessen arbeidskrevende. Det står overfor tekniske vanskeligheter som behovet for stor prøvestørrelse, renhet av utbyttet og reproduserbarhet av teknikken⁵. Permeabiliserte celler tilbyr en løsning for ulempene ved mitokondrieisolasjon; Rutinemessige permeabiliserende midler av vaskemiddel natur er imidlertid ikke spesifikke og kan skade mitokondriemembraner⁵.

Rekombinant perfringolysin O (rPFO) ble tilbudt som et selektivt plasmamembranpermeabiliserende middel⁷, og det ble brukt vellykket i kombinasjon med en ekstracellulær fluksanalysator i flere studier^7,8,9,10. Vi har modifisert en protokoll ved hjelp av rPFO for å screene mitokondrie substrat flux ved hjelp av XFe96 ekstracellulær flux analysator. I denne protokollen sammenlignes fire forskjellige substratoksidasjonsveier i to cellulære fenotyper mens de har tilstrekkelige replikeringer og riktig kontroll for hvert testet materiale.

Protocol

1. En dag før analysen Fremstilling av reagenser og substrater. Mitokondrieanalyseløsning (MAS): Klargjør lagerløsninger for alle reagenser som beskrevet i tabell 1. Varm opp lagrene av mannitol og sukrose til 37 °C for å oppløses helt. Bland reagensene for å forberede 2x MAS, og varm deretter blandingen til 37 °C. Juster pH med 5N KOH til 7,4 (~7 ml), tilsett deretter vann for å bringe volumet opp til 1 L. Filtersterilisere og lagre aliquots ved -20 °C til måledagen. …

Representative Results

Begynn med å normalisere resultatene til det andre målet for baseline respirasjon for å vise verdier som oksygenforbruksrateprosent (OCR%). Resultatene av analysen vises i Figur 5, Figur 6, Figur 7 og Figur 8. Det er viktig å tildele de riktige bakgrunnsbrønnene for hver gruppe og inaktivere bakgrunnsbrønnene til andre grupper. Figur 5</stron…

Discussion

Denne protokollen er en endring av tidligere publiserte studier^7,8,9,10 og produktbrukerhåndboken. I motsetning til produsentens protokoll brukes 2x MAS i stedet for 3x MAS, siden 2× MAS er lettere å oppløse og danner ikke nedbør etter frysing. Frosne 2x MAS aliquots kan lagres opptil seks måneder og vise konsistente resultater. En annen forskjell er å inkludere ADP i komponentene i 2x M…

Materials

Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate	Merck	A5285	store at -20 °C
Antimycin A	Merck	A8674	store at -20 °C
Bovine serum albumin	Merck	A3803	store at 2 – 8 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Merck	C2920	store at -20 °C
Dimethyl sulfoxide	Merck	D8418	store at RT
D-Mannitol	Merck	63559	store at RT
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco	14190-144	store at RT
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Merck	03777	store at RT
HEPES	Merck	H7523	store at RT
L(-)Malic acid disodium salt	Merck	M9138	store at RT
L-Glutamic acid sodium salt hydrate	Merck	G5889	store at RT
Magnissium chloride hexahydrate	Merck	M2670	store at RT
Oligomycin	Merck	O4876	store at -20 °C
Palmitoyl-DL-carnitine chloride	Merck	P4509	store at -20 °C
Potassium hydroxide	Merck	484016	store at RT
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655	store at RT
Rotenone	Merck	R8875	store at -20 °C
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Download from www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent technologies	102416-100	XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates
Sodium pyruvate	Merck	P2256	store at 2 – 8 °C
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Merck	S2378	store at RT
Sucrose	Merck	S7903	store at RT
Water	Merck	W3500	store at RT
XF calibrant	Agilent technologies	100840-000	store at RT
XF Plasma membrane permeabilizer	Agilent technologies	102504-100	Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C