Medindo flux de substrato mitocondrial em células o-permeabilizadas de permeabilized recombinante

Summary

Neste trabalho, descrevemos um protocolo modificado para testar o flux de substrato respiratório mitocondrial usando perfringolysina recombinante O em combinação com respirometria à base de microplato. Com este protocolo, mostramos como a metformina afeta a respiração mitocondrial de duas linhas diferentes de células tumorais.

Abstract

O flux de substrato mitocondrial é uma característica distintiva de cada tipo de célula, e mudanças em seus componentes como transportadores, canais ou enzimas estão envolvidas na patogênese de várias doenças. Flux de substrato mitocondrial pode ser estudado usando células intactas, células permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas. Investigar células intactas encontra vários problemas devido à oxidação simultânea de diferentes substratos. Além disso, vários tipos de células contêm lojas internas de diferentes substratos que complicam a interpretação dos resultados. Métodos como isolamento mitocondrial ou uso de agentes permeabilizantes não são facilmente reprodutíveis. Isolar mitocôndrias puras com membranas intactas em quantidades suficientes de pequenas amostras é problemático. O uso de permeabilizers não seletivos causa vários graus de danos inevitáveis da membrana mitocondrial. A perfringolysina recombinante O (rPFO) foi oferecida como um permeabilizer mais apropriado, graças à sua capacidade de permeabilize seletivamente a membrana plasmática sem afetar a integridade mitocondrial. Quando usado em combinação com respirometria de microplaco, permite testar o fluxo de vários substratos mitocondriais com réplicas suficientes dentro de um experimento enquanto usa um número mínimo de células. Neste trabalho, o protocolo descreve um método para comparar o flux de substrato mitocondrial de dois fenótipos ou genótipos celulares diferentes e pode ser personalizado para testar vários substratos mitocondriais ou inibidores.

Introduction

A respirometria baseada em microplacar revolucionou a pesquisa mitocondrial, permitindo o estudo da respiração celular de um pequeno tamanho amostral¹. A respiração celular é geralmente considerada como um indicador de função mitocondrial ou “disfunção”, apesar do fato de que a gama mitocondrial de funções se estende além da produção de energia². Em condições aeróbicas, as mitocôndrias extraem a energia armazenada em diferentes substratos, quebrando e convertendo esses substratos em intermediários metabólicos que podem alimentar o ciclo do ácido cítrico³ (Figura 1). O fluxo contínuo de substratos é essencial para o fluxo do ciclo do ácido cítrico gerar “doadores de elétrons” de alta energia, que fornecem elétrons para a cadeia de transporte de elétrons que gera um gradiente de prótons através da membrana mitocondrial interna, permitindo atp-synthase para fosforilato ADP para ATP⁴. Portanto, um projeto experimental para avaliar a respiração mitocondrial deve incluir a natureza amostral (células intactas, células permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas) e substratos mitocondriais.

As células mantêm um estoque de substratos indígenas⁵, e mitocôndrias oxidam vários tipos de substratos simultaneamente⁶, o que complica a interpretação dos resultados obtidos a partir de experimentos realizados em células intactas. Uma abordagem comum para investigar a capacidade mitocondrial de oxidar um substrato selecionado é isolar mitocôndrias ou permeabiliizar as células investigadas⁵. Embora mitocôndrias isoladas sejam ideais para estudos quantitativos, o processo de isolamento é trabalhoso. Enfrenta dificuldades técnicas como a necessidade de grande tamanho amostral, pureza do rendimento e reprodutibilidade da técnica⁵. As células permeabilizadas oferecem uma solução para as desvantagens do isolamento mitocondrial; no entanto, os agentes de permeabilização de rotina da natureza detergente não são específicos e podem danificar as membranas mitocondriais⁵.

A perfringolysina recombinante O (rPFO) foi oferecida como um agente de permeabilizing de membrana plasmática seletiva⁷, e foi utilizada com sucesso em combinação com um analisador de fluxo extracelular em vários estudos^7,8,9,10. Modificamos um protocolo usando rPFO para tela de flux de substrato mitocondrial usando o analisador de fluxo extracelular XFe96. Neste protocolo, quatro diferentes vias oxidantes de substratos em dois fenótipos celulares são comparadas, tendo réplicas suficientes e o controle adequado para cada material testado.

Protocol

1. Um dia antes do ensaio Preparação de reagentes e substratos. Solução de ensaio mitocondrial (MAS): Prepare soluções de estoque de todos os reagentes descritos na Tabela 1. Aqueça os estoques de manitol e sacarose a 37 °C para dissolver completamente. Misture os reagentes para preparar 2x MAS e aqueça a mistura a 37 °C. Ajuste o pH com 5N KOH para 7,4 (~7 mL), depois adicione água para levar o volume até 1 L. Estérilize o filtro e armazene as alíquotas a -20 °C até o …

Representative Results

Comece pela normalização dos resultados para a segunda medição da respiração da linha de base para mostrar valores como percentual de taxa de consumo de oxigênio (OCR%). Os resultados do ensaio são mostrados nas Figuras 5,Figura 6,Figura 7 e Figura 8. É importante atribuir os poços de fundo adequados para cada grupo e inativar os poços de fundo de outros gru…

Discussion

Este protocolo é uma modificação dos estudos publicados anteriormente^7,8,9,10 e o guia do usuário do produto. Em contraste com o protocolo do fabricante, o 2x MAS é usado em vez de 3x MAS, uma vez que 2× MAS é mais fácil de dissolver e não forma precipitações após o congelamento. Alíquotas MAS 2x congeladas podem ser armazenadas até seis meses e mostrar resultados consistentes. Ou…

Materials

Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate	Merck	A5285	store at -20 °C
Antimycin A	Merck	A8674	store at -20 °C
Bovine serum albumin	Merck	A3803	store at 2 – 8 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Merck	C2920	store at -20 °C
Dimethyl sulfoxide	Merck	D8418	store at RT
D-Mannitol	Merck	63559	store at RT
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco	14190-144	store at RT
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Merck	03777	store at RT
HEPES	Merck	H7523	store at RT
L(-)Malic acid disodium salt	Merck	M9138	store at RT
L-Glutamic acid sodium salt hydrate	Merck	G5889	store at RT
Magnissium chloride hexahydrate	Merck	M2670	store at RT
Oligomycin	Merck	O4876	store at -20 °C
Palmitoyl-DL-carnitine chloride	Merck	P4509	store at -20 °C
Potassium hydroxide	Merck	484016	store at RT
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655	store at RT
Rotenone	Merck	R8875	store at -20 °C
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Download from www.agilent.com
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent technologies	102416-100	XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates
Sodium pyruvate	Merck	P2256	store at 2 – 8 °C
Sodium succinate dibasic hexahydrate	Merck	S2378	store at RT
Sucrose	Merck	S7903	store at RT
Water	Merck	W3500	store at RT
XF calibrant	Agilent technologies	100840-000	store at RT
XF Plasma membrane permeabilizer	Agilent technologies	102504-100	Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C