Het huidige protocol beschrijft beknopte experimentele details over de evaluatie en interpretatie van in vivo koppelgegevens verkregen via elektrische stimulatie van de gemeenschappelijke peroneuszenuw bij verdoofde varkens.
Betrouwbare beoordeling van de kracht van de skeletspier is misschien wel de belangrijkste uitkomstmaat in neuromusculaire en musculoskeletale aandoeningen en letselstudies, met name bij het evalueren van de werkzaamheid van regeneratieve therapieën. Bovendien is een cruciaal aspect van het vertalen van veel regeneratieve therapieën het aantonen van schaalbaarheid en effectiviteit in een groot diermodel. Verschillende fysiologische preparaten zijn opgezet om intrinsieke spierfunctie-eigenschappen te evalueren in fundamentele wetenschappelijke studies, voornamelijk in modellen voor kleine dieren. De praktijken kunnen worden gecategoriseerd als: in vitro (geïsoleerde vezels, vezelbundels of hele spieren), in situ (spier met intacte vascularisatie en innervatie maar distale pees bevestigd aan een krachtomvormer) en in vivo (structuren van de spier of spiereenheid blijven intact). Er zijn sterke en zwakke punten aan elk van deze voorbereidingen; een duidelijk voordeel van in vivo sterktetesten is echter de mogelijkheid om herhaalde metingen uit te voeren bij hetzelfde dier. Hierin worden de materialen en methoden gepresenteerd om het isometrische koppel geproduceerd door de achterste dorsiflexorspieren in vivo te beoordelen als reactie op standaard peroneale elektrische stimulatie bij verdoofde varkens.
De primaire functie van skeletspieren is het produceren van kracht, wat uiteindelijk activiteiten zoals ademhalen, eten en ambuleren mogelijk maakt. Aandoeningen die de functionele capaciteit van de skeletspieren verminderen, kunnen leiden tot verminderde prestaties (beroeps- of sport), invaliditeit of de dood. Het behoud van spiermassa en functie in vergrijzende populaties is bijvoorbeeld positief geassocieerd met de kwaliteit van leven en het vermogen om basis- en instrumentele activiteiten van het dagelijks leven uit te voeren 1,2. En afnemende spierkracht bij Duchenne spierdystrofiepatiënten resulteert in het onvermogen om te ambuleren en respiratoire insufficiëntie, wat uiteindelijk bijdraagt aan vroegtijdige mortaliteit 3,4,5. Spierkrachtmeting is dus een kritische uitkomstmaat in studies met neuromusculaire aandoeningen of letsel.
Maximaal vrijwillig isometrisch of isokinetisch koppel (en/of vermoeidheidsindex) wordt vaak gebruikt als een index van functionele capaciteit in klinische studies6. In dierstudies kunnen analoge metingen in vivo worden uitgevoerd met behulp van elektrische zenuwstimulatie terwijl ze onder narcose zijn. Met name in vivo preparaten zijn minimaal invasief met spieren, pezen, vasculatuur en innervatie die intact blijven en daarom herhaalde functionele beoordelingenmogelijk maken 7,8,9,10,11. Dit preparaat wordt vaak gebruikt in kleine knaagdiermodellen en in mindere mate in grotere diermodellen zoals konijnen12, honden13,14, schapen15 en varkens16,17. Het algemene gebruik van een dergelijke methodologie kan van invloed zijn op veel translationele onderzoeksstudies, zoals in genetisch gemanipuleerde varkensmodellen van spinale musculaire atrofie (SMA)18. Hierin worden methoden gepresenteerd om het door zenuwstimulatie geïnduceerde maximale isometrische koppel van de varkens dorsiflexor spiergroep in vivo te beoordelen. De gepresenteerde technieken werden aanvankelijk aangepast van de technieken die oorspronkelijk waren ontwikkeld om het koppel van de voorste kruisspier van de muis19,20 te beoordelen en vervolgens verfijnd door ervaring met het onderzoeken van koppelproducerende capaciteit na letsel 17,21,22,23,24,25,26,27,28 en tijdens de ontwikkeling16 in verschillende varkensmodellen.
Dit protocol benadrukt in vivo isometrische koppelmeting met behulp van een methodologie die een computer vereist die is geïntegreerd met een loadcel en elektrische stimulator. De hier gepresenteerde methoden maken gebruik van een in de handel verkrijgbare geïntegreerde varkensisometrische voetplaattestapparatuur, platformapparatuur en bijbehorende software (zie Tabel met materialen). De methodologie kan echter worden aangepast om andere commercieel beschikbare of op maat gemaakte software, data-acquisitie-apparaten en stimulatoren te gebruiken. Deze methoden zijn bedoeld voor gebruik in een speciale chirurgische suite voor grote dieren vol met standaardapparatuur, zoals: vergrendelbare operatietafel, tweede vergrendelingstafel van gelijke hoogte voor het testplatform, ventilator- en bewakingsapparatuur en verwarmingsmat of andere apparaten om de lichaamstemperatuur te handhaven.
De volgende teamleden zijn nodig om deze methoden uit te voeren: een bekwame anesthesietechnicus en twee studiepersoneel om de functionele tests uit te voeren. Deze mensen zullen samenwerken voor de initiële stabilisatie van de ledemaat op het platformapparaat. Vervolgens is een van de twee medewerkers verantwoordelijk voor de plaatsing/positionering van de elektrode en de andere voor de computertoepassingen tijdens het testen.
Kritieke stappen, wijzigingen en probleemoplossing
Om de variabiliteit van gegevens te minimaliseren en het succes van de aanpak te maximaliseren, worden de volgende kritieke stappen benadrukt.
Optimale zenuwstimulatie
Deze experimentele benadering begint met zenuw axon depolarisatie en vertrouwt op de juiste plaatsing van de elektrode en geoptimaliseerde elektrische stimulatie. Een post-mortem analyse van zenuwanatomie met betrekking tot botachtige oriëntatiepunten kan helpen bij het visualiseren van de juiste plaatsing van de elektrode tijdens het testen. Het verkrijgen van maximaal twitch-koppel helpt bij het bepalen van de juiste stroom (in milliamperes; mA) die aan het zenuwaxon wordt geleverd. Er zijn twee waarden om in gedachten te houden bij het optimaliseren van zenuwstimulatie aan het begin van het testen: (1) de twitch-to-tetanic ratio is ~ 1: 5, bijvoorbeeld ~ 2 N · m twitch-koppel komt overeen met een 10 N · m tetanisch koppel (figuur 3); en (2) het typische koppel tot de lichaamsgewicht is ~0,3 N·m per kg lichaamsgewicht (figuur 4). Als de piekkoppels laag lijken, verwijdert u de elektroden en probeert u een andere plaatsing. Zorg ervoor dat u de stimulatorinstellingen, BNC-verbindingen en elektrodeverbindingen controleert. Het opnieuw plaatsen van de elektrode kan nodig zijn tussen de weeën door als er te veel beweging is tijdens het positioneren van de ledemaat tussen gewrichtshoeken, zoals hierboven vermeld (figuur 2). Houd er rekening mee dat experimentele en interventionele benaderingen van invloed kunnen zijn op deze waarden.
Goede biomechanische uitlijning
Beginnende spierlengte beïnvloedt spiercontractiele kracht (de lengte-spanningsrelatie) en spierlengte kan veranderen op basis van de uitlijning van heup-, knie- en enkelgewrichten. De gewrichtshoeken moeten worden gestandaardiseerd tussen ledematen en tussen varkens. Een enkelgewrichtshoek van 90° wordt sterk aanbevolen voor de heup en knie. Een licht plantarflexe enkelpositie (~30° van de neutrale 0° enkelgewrichtshoek) is optimaal voor pieksterkte. Het weerspiegelt de natuurlijke anatomische positie van het enkelgewricht bij zowel varkens als honden tijdens het staan. Alle verbindingen moeten ook parallel lopen met het voetpedaal en de koppelomvormers om verlies van meetbaar koppel als gevolg van de bijdrage van een loodrechte koppelvector te voorkomen. Het inspecteren van de heup-knie-enkelgewrichtshoeken en voet-pedaal-gewrichtsuitlijning wordt sterk aanbevolen na het vastzetten van de voet aan het voetpedaal en het vastzetten van het kniegewricht met de ledemaatklemstaven (figuur 1). Als er een verkeerde uitlijning is, ontgrendel en verwijder dan de staven en verplaats het varken op de operatietafel. Hoewel het standaardiseren van gewrichtshoeken in verschillende studies van cruciaal belang is voor het minimaliseren van gegevensvariantie, zijn er beperkingen aan biomechanische uitlijning die opmerkelijk zijn, hieronder besproken.
Betekenis ten opzichte van bestaande of alternatieve methoden
Alternatieve voorbeelden van klinisch relevante en niet-invasieve beoordelingen van spierfunctie die kunnen worden gebruikt voor varkensmodellen zijn loopbandwandelafstand, EMG en actieve spierschuifgolfelektrografie. Als de 6 minuten lopen test bij mensen, kan een loopband loopband looptest ziekteprogressie en interventiesucces bij grote dieren evalueren 33,34,35. Meestal worden dieren na een acclimatisatieperiode tot het einde van de naleving gelopen bij verschillende loopbandsnelheden en / of hellingsniveaus. Voedselbeloningen zijn vaak nodig om maximale motivatie te bereiken. Loopbandwandelresultaten bieden echter alleen indirecte interpretaties van spiercontractiele functie als gevolg van beperkingen zoals onderwerpmotivatie, niet-maximale motorische eenheidsrekrutering en inherente co-afhankelijkheid van andere lichaamssystemen zoals het cardiovasculaire, skelet- en ademhalingssysteem.
Aan de andere kant biedt EMG een iets betere directe beoordeling van het skeletspieren, omdat EMG-elektroden direct op de spiergroep van belang worden geplaatst 36,37,38. EMG-elektroden meten vervolgens de collectieve spieractiviteit (gedepolariseerde spiervezels). Deze spieractiviteit is gebaseerd op rekrutering van motorische eenheden en snelheidscodering (de frequentie van actiepotentialen die naar gerekruteerde motoreenheden worden verzonden). Het scheiden van de relatieve bijdragen van motorische eenheidsrekrutering versus tariefcodering is echter onmogelijk met oppervlakte-EMG. Verder is EMG afhankelijk van de bereidheid van het onderwerp om maximale contracties te genereren, en dit niveau van samenwerking is onwaarschijnlijk in modellen met grote dieren. Hoewel het informatief kan zijn om veranderingen in EMG tijdens de loopcyclus te beoordelen, vertegenwoordigen deze gegevens geen maximaal functioneel vermogen van de skeletspiergroep van belang. Echografie-gebaseerde beeldvorming met behulp van B-modus en shear-wave elastografie is een andere niet-invasieve modaliteit die wordt gebruikt om de spierfunctie te evalueren. Er is een goede correlatie tussen Young’s modulus gemeten door elastografie en toenemende spierbelasting39,40. Shear-wave elastografie is gevalideerd en gebruikt als een kwantitatieve maat voor passieve weefselstijfheid 41,42,43,44,45, inclusief in een varkensvolumetrisch spierverliesletselmodel 23. Het kan ook worden gebruikt als een indirecte meting van de productie van actieve spierkracht39. Beperkingen die verwant zijn aan EMG voor de bereidheid van het onderwerp en de samenwerking om weeën uit te voeren, zijn echter nog steeds aanwezig.
Het hier beschreven in vivo protocol, in tegenstelling tot loopband loopafstand en EMG, biedt een betrouwbare, reproduceerbare en maximale beoordeling van de spierfunctie. Dit protocol roept spiercontracties op op een gecontroleerde, kwantificeerbare manier die onafhankelijk is van motivatie. In het bijzonder worden percutane elektroden gebruikt om zenuwen axonen te stimuleren die het centrale zenuwstelsel omzeilen. Depolarisatie van de zenuwaxonen betrekt alle motorische eenheden en elimineert variabiliteit geassocieerd met motorische eenheidsrekrutering. Bovendien controleert de onderzoeker de snelheidscodering (stimulatiefrequentie). De resulterende neuromusculaire fysiologie die van toepassing is op deze benadering begint met voltage-gated natriumkanaalactivering op de knooppunten van Ranvier. Alle daaropvolgende (of stroomafwaartse) fysiologie is betrokken, inclusief excitatie-contractiekoppeling en cross-bridge fietsen. Een belangrijk voordeel van de in vivo niet-invasieve spieranalyse is dat de contractiele spierfunctie herhaaldelijk kan worden gemeten, bijvoorbeeld wekelijks, om de spierkracht te controleren na letsel, interventie of over een ziekteprogressie.
Beperkingen van de methode
De in vivo apparatuur beschreven in dit protocol maakt passief en actief isometrisch koppel mogelijk als functie van de gewrichtshoek en stimulatiefrequentie. Het gebruikte testapparaat ondersteunt niet de meting van dynamische contracties (bijvoorbeeld isokinetische excentrische of concentrische contracties). Het apparaat maakt een bewegingsbereik van 105° mogelijk om de koppel-gewrichtshoekrelatie te karakteriseren en maakt gebruik van een loadcel met een maximaal koppelbereik van ~ 50 N ·m. Specifieke experimentele vragen kunnen prestatiekenmerken vereisen die buiten deze specificaties vallen. Met name de loadcel op dit beschreven apparaat kan indien nodig worden verwisseld voor een groter koppelbereik.
Het hierin beschreven protocol om de maximale neuromusculaire sterkte in vivo te meten, heeft opmerkelijke beperkingen. Ten eerste vereist deze methode anesthesie, die anders kan worden uitgevoerd per dierfaciliteit protocollen en middelen. Van anesthetica is bekend dat ze verschillende effecten hebben op de neuromusculaire functie en er is aangetoond dat ze de in vivo dorsiflexorkoppelproductie van muizen op een verdovingstype en dosisafhankelijke manier veranderen29. De differentiële effecten van anesthetica op het in vivo koppel van grote dieren zijn onduidelijk; daarom moeten controle- en experimentele groepen dezelfde anesthesiemiddelen hebben (bijvoorbeeld alle groepen die ketamine toegediend krijgen) om deze variabiliteit te beheersen. Ten tweede beperkt het vertrouwen op in vivo diffusiepatronen de exploratie van cellulaire mechanismen van contractiele disfunctie en acute geneesmiddeltoxiciteit. Cafeïne kan bijvoorbeeld worden gebruikt tijdens in vitro orgaanbadtests van een geïsoleerde spier om de afgifte van sarcoplasmatisch reticulumcalcium te stimuleren, waarbij excitatie-contractiekoppeling46 direct wordt omzeild. De hoeveelheid cafeïne om dit effect (mM) te induceren is dodelijk in een in vivo setting. Geneesmiddelinvloeden op het hele lichaam (bijv. Nier- / leverstress) en daaropvolgende factoren die in de circulatie worden uitgescheiden, moeten worden overwogen als deze aanpak wordt gebruikt voor geneesmiddelenscreening op acute spierkracht23. Ten derde wijkt het gebruik van maximale elektrische zenuwstimulatie af van vrijwillige rekruteringsstrategieën, zoals hierboven besproken, en weerspiegelt daarom geen veranderingen in kracht die te wijten kunnen zijn aan neuromusculaire rekruteringsaanpassingen.
In vivo koppelmetingen kunnen ook worden beperkt met betrekking tot het opzetten van een specifiek mechanisme voor experimentele waarnemingen. Zo is het koppel rond het enkelgewricht niet alleen afhankelijk van de spierkrachtproductie, maar ook van de pees- en gewrichts- en bindweefseleigenschappen. Bovendien wordt kracht gegenereerd door groepen spieren, met name de plantaire buigers (gastrocnemius-, soleus- en plantarisspieren) en de dorsiflexoren (peroneus tertius, tibialis en digitorumspieren) bij varkens. Daarom vereisen interpretaties van maximale in vivo koppelgegevens dat rekening wordt gehouden met mogelijke musculotendineuze en anatomische veranderingen en zijn ze beperkt tot spiergroepen, niet tot individuele spieren. In verband hiermee bestaan spiergroepen vaak uit een mengsel van overwegend snelle en langzame spiervezels, zoals respectievelijk de gastrocnemius en de soleusspier van de plantaire buigers. Contractiele eigenschappen zoals de snelheid van contractie en ontspanning (of time-to-peak contractie en half-relaxatietijd) zijn geen betrouwbare indicatoren voor vezeltypefysiologie met behulp van in vivo versus geïsoleerde spierpreparaten, zoals in vitro of in situ testprotocollen47. Geïsoleerde spierpreparaten zijn ook superieur in het begrijpen van de invloed van biomechanische parameters op de spierfunctie omdat eigenschappen zoals spierlengte nauwkeurig kunnen worden geregeld; het is belangrijk om te benadrukken dat de gewrichtshoek-koppelrelatie niet direct equivalent is aan de spierlengte-krachtrelatie, omdat pees (bijv. Slap), spier (bijv. Pennatiehoek, sarcomere overlap) en gewrichtseigenschappen (bijv. Momentarm) die bijdragen aan de koppelproductie afhankelijk zijn van de gewrichtshoek. Daartoe zou het in situ testen van grote dieren48 een waardevolle aanvulling kunnen zijn op in vivo testen, rekening houdend met het feit dat in situ testen een terminaal experiment is. Andere verbeteringen in het huidige protocol die in de toekomst kunnen worden onderzocht om het mechanistische inzicht van experimentele bevindingen te verbeteren, zijn onder meer het gebruik van ultrasone B-modus beeldvorming om spier- en peesarchitectuureigenschappen te meten en implantatie van een peeskrachttransducer om spierkracht te meten tijdens vrijwillige en elektrisch gestimuleerde contracties49.
Belang en mogelijke toepassingen van de methode
Dit protocol evalueert de in vivo koppelproducerende capaciteit van de varkens dorsiflexor spiergroep, waarbij een niet-invasieve methode wordt gedemonstreerd om de winst of het verlies van spierfunctie in een fysiologische setting te beoordelen. Omdat de methodologie niet-terminaal is voor het varken, kan deze ook worden gebruikt om de spierfunctie bij dezelfde proefpersonen longitudinaal te evalueren tijdens de progressie van een ziekte, of vóór, tijdens en volgens een behandelingsstrategie. Als zodanig kan een experimenteel ontwerp met herhaalde metingen robuuste statistische vergelijkingen mogelijk maken met meer vermogen en minder dieren in vergelijking met onafhankelijke metingen. Bovendien is skeletspierdisfunctie een saillant onderdeel van verschillende ziekteprocessen en -aandoeningen, zoals chronische ziektegerelateerde spierverspilling (bijv. Hartfalen, nierfalen, AIDS, kanker, enz.), Spierdystrofie, neurodegeneratieve ziekten (bijv. SMA of amyotrofische laterale sclerose; ALS), veroudering (d.w.z. sarcopenie) en toxiciteit van geneesmiddelen. De functionele capaciteit van de skeletspier is een kritische primaire uitkomstmaat voor interventies zoals lichaamsbeweging, voeding en medicamenteuze en regeneratieve geneeskunde therapieën. Het hierin beschreven protocol om de koppelproductiecapaciteit van varkens in vivo betrouwbaar te evalueren, kan dus worden gebruikt in tal van onderzoekstoepassingen. Het kan een belangrijke rol spelen bij het verkrijgen van uitgebreide diergegevens voor de vertaling van het ontwikkelen van therapieën.
The authors have nothing to disclose.
Het gepresenteerde werk en de gepresenteerde gegevens werden breed ondersteund door het US Army Medical Research and Material Command aan BTC en SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); en het Department of Veterans Affairs, Veterans Health Administration, Office of Research and Development (I21 RX003188) aan JAC en Dr. Luke Brewster. De auteurs erkennen dankbaar de USAISR Veterinary Service and Comparative Pathology Branches en UMN Advanced Preclinical Imaging Center voor technische assistentie bij het voltooien van deze studies.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |