הפרוטוקול הנוכחי מתאר פרטים ניסיוניים תמציתיים על הערכה ופרשנות של נתוני מומנט in vivo המתקבלים באמצעות גירוי חשמלי של העצב הפרונאלי הנפוץ בחזירים מורדמים.
הערכה מהימנה של חוזק שרירי השלד היא ללא ספק מדד התוצאה החשוב ביותר במחקרי מחלות ופציעות נוירומוסקולריות ושלד,במיוחד בעת הערכת היעילות של טיפולים רגנרטיביים. בנוסף, היבט קריטי בתרגום טיפולים רגנרטיביים רבים הוא הפגנת מדרגיות ויעילות במודל גדול של בעלי חיים. תכשירים פיזיולוגיים שונים הוקמו כדי להעריך תכונות תפקוד שריר מהותיות במחקרים מדעיים בסיסיים, בעיקר במודלים של בעלי חיים קטנים. ניתן לסווג את התרגולים כ: in vitro (סיבים מבודדים, צרורות סיבים או שריר שלם), in situ (שריר עם כלי דם שלמים ו העצבנות אך גיד דיסטלי המחובר למתמר כוח), ו – in vivo (מבנים של השריר או יחידת השריר נשארים שלמים). יש חוזקות וחולשות לכל אחת מההכנות הללו; עם זאת, יתרון ברור של בדיקות חוזק in vivo הוא היכולת לבצע מדידות חוזרות ונשנות באותה חיה. כאן מוצגים החומרים והשיטות להערכה מהימנה של המומנט האיזומטרי המיוצר על ידי שרירי הדורסיפלקסור האחוריים in vivo בתגובה לגירוי חשמלי פרונאלי סטנדרטי בחזירים מורדמים.
הפונקציה העיקרית של שרירי השלד היא לייצר כוח, שבסופו של דבר הופך פעילויות כגון נשימה, אכילה ואמבולציה לאפשריות. מצבים המפחיתים את יכולת התפקוד של שרירי השלד עלולים להוביל לירידה בביצועים (תעסוקתיים או ספורטיביים), לנכות או למוות. לדוגמה, שמירה על מסת שריר ותפקוד באוכלוסיות מזדקנות קשורה באופן חיובי לאיכות החיים וליכולת לבצע פעילויות בסיסיות ואינסטרומנטליות של חיי היומיום 1,2. בנוסף, ירידה בכוח השרירים בחולי ניוון שרירים של דושן גורמת לחוסר יכולת לאמבולציה ולכשל נשימתי, ובסופו של דבר תורמת לתמותה מוקדמתשל 3,4,5. לפיכך, מדידת כוח השרירים היא מדד תוצאה קריטי במחקרים המערבים מחלה עצבית-שרירית או פציעה.
מומנט איזומטרי מרצון מקסימלי או איזוקינטי (ו/או מדד עייפות) משמש לעתים קרובות כמדד ליכולת תפקודית במחקרים קליניים6. במחקרים בבעלי חיים, ניתן לבצע מדידות אנלוגיות in vivo באמצעות גירוי עצבי חשמלי בזמן הרדמה. יש לציין כי תכשירי in vivo הם זעיר פולשניים עם שרירים, גידים, כלי דם ועיוורון שנותרו ללא פגע ולכן מאפשרים הערכות תפקודיות חוזרות ונשנות 7,8,9,10,11. תכשיר זה נפוץ במודלים של מכרסמים קטנים ובמידה פחותה במודלים גדולים יותר של בעלי חיים כגון ארנבות12, כלבים13,14, כבשים15 וחזירים16,17. השימוש הכללי במתודולוגיה כזו עשוי להיות בעל השפעה על מחקרים תרגומיים רבים, כגון במודלים מהונדסים גנטית של חזיר (חזיר) של ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA)18. כאן מוצגות שיטות להערכת מומנט איזומטרי מקסימלי המושרה על ידי גירוי עצבי של קבוצת השרירים החזירית דורסיפלקסור in vivo. הטכניקות שהוצגו הותאמו בתחילה מאלו שפותחו במקור כדי להעריך את מומנט השריר הקדמי של העכבר19,20 ולאחר מכן שוכללו באמצעות ניסיון בחקר כושר ייצור המומנט לאחר פציעה 17,21,22,23,24,25,26,27,28 ובמהלך פיתוח16 במודלים שונים של חזירים.
פרוטוקול זה מדגיש מדידת מומנט איזומטרי in vivo באמצעות מתודולוגיה הדורשת מחשב המשולב עם תא עומס וממריץ חשמלי. השיטות המוצגות כאן משתמשות במנגנון בדיקה משולב מסחרי של לוחית רגל איזומטרית של חזירים, מנגנון פלטפורמה ותוכנה מתאימה (ראו טבלת חומרים). עם זאת, ניתן להתאים את המתודולוגיה לשימוש בתוכנות אחרות הזמינות מסחרית או מותאמות אישית, בהתקני רכישת נתונים ובממריצים. שיטות אלה מיועדות לשימוש בסוויטה כירורגית ייעודית לבעלי חיים גדולים, הגדושה בציוד סטנדרטי כגון: נעילת שולחן כירורגי, שולחן נעילה שני בגובה שווה לפלטפורמת הבדיקה, מכשירי הנשמה וניטור, ומשטח חימום או מכשירים אחרים לשמירה על טמפרטורת הגוף.
חברי הצוות הבאים נדרשים לבצע שיטות אלה: טכנאי הרדמה מיומן אחד ושני אנשי מחקר לביצוע הבדיקה התפקודית. אנשים אלה יעבדו יחד לייצוב הראשוני של הגפה במנגנון הפלטפורמה. לאחר מכן, אחד משני אנשי הצוות יהיה אחראי על מיקום / מיקום האלקטרודה והשני על יישומי המחשב במהלך הבדיקה.
שלבים קריטיים, שינויים ופתרון בעיות
כדי למזער את השתנות הנתונים ולמקסם את הצלחת הגישה, מודגשים השלבים הקריטיים הבאים.
גירוי עצבי אופטימלי
גישה ניסיונית זו מתחילה בדה-פולריזציה של אקסון העצבים ומסתמכת על מיקום נכון של האלקטרודות ועל גירוי חשמלי אופטימלי. ניתוח לאחר המוות של אנטומיה עצבית הקשורה לציוני דרך בוניים יכול לעזור לדמיין מיקום נכון של אלקטרודות במהלך הבדיקה. רכישת מומנט עוויתות מקסימלי מסייעת בקביעת זרם מתאים (במיליאמפרות; mA) המועבר לאקסון העצבי. ישנם שני ערכים שיש לזכור בעת אופטימיזציה של גירוי עצבי בתחילת הבדיקה: (1) היחס בין עווית לטטניקה הוא ~1:5, למשל, מומנט עוויתות של ~2 N·m מתאים למומנט טטאני של 10 N·m (איור 3); ו-(2) המומנט האופייני למסת הגוף הוא ~0.3 N·m לכל מסת גוף של ק”ג (איור 4). אם מומנטי השיא של עוויתות נראים נמוכים, הסר את האלקטרודות ונסה מיקום אחר. הקפד לבדוק הגדרות מגרה, חיבורי BNC וחיבורי אלקטרודות. ייתכן שיהיה צורך במיקום מחדש של האלקטרודה בין התכווצויות אם יש יותר מדי תנועה במהלך מיקום הגפה בין זוויות המפרקים, כפי שצוין לעיל (איור 2). שים לב שגישות ניסיוניות והתערבותיות עשויות להשפיע על ערכים אלה.
יישור ביומכני תקין
אורך השריר ההתחלתי משפיע על כוח התכווצות השריר (הקשר בין אורך למתח), ואורך השריר יכול להשתנות בהתאם ליישור מפרק הירך, הברך והקרסול. זוויות המפרק חייבות להיות סטנדרטיות בין הגפיים ובין חזירים. זווית מפרק קרסול 90° מומלצת בחום לירך ולברך. תנוחת קרסול מעט פלנטרית (כ-30° מזווית מפרק הקרסול הנייטרלית של 0° ) אופטימלית לחוזק שיא. הוא משקף את המיקום האנטומי הטבעי של מפרק הקרסול הן בחזירים והן בכלבים בזמן העמידה. כל המפרקים צריכים להיות מקבילים גם עם מתמרים של דוושת כף הרגל והמומנט כדי למנוע אובדן מומנט מדיד בשל התרומה של וקטור מומנט מאונך. מומלץ מאוד לבחון את זוויות מפרק הירך-ברך-קרסול ואת יישור מפרק הדוושה-כף-רגל לאחר הצמדת כף הרגל לדוושת כף הרגל ואבטחת מפרק הברך באמצעות מוטות הידוק הגפיים (איור 1). אם יש חוסר התאמה, לפתוח ולהסיר את הסורגים ולמקם מחדש את החזיר על שולחן הניתוח. בעוד שסטנדרטיזציה של זוויות משותפות בין מחקרים היא קריטית למזעור השונות בנתונים, ישנן מגבלות ליישור ביומכני בולטות, שיידונו להלן.
משמעות ביחס לשיטות קיימות או חלופיות
דוגמאות מתחלפות להערכות רלוונטיות מבחינה קלינית ולא פולשניות של תפקוד השרירים שיכולות לשמש למודלים של חזירים כוללות מרחק הליכה של הליכון, EMG ואלקטרוגרפיה פעילה של גלי גזירה בשרירים. כמבחן הליכה של 6 דקות בבני אדם, מבחן הליכה על הליכון יכול להעריך את התקדמות המחלה ואת הצלחת ההתערבות בבעלי חיים גדולים 33,34,35. בדרך כלל, לאחר תקופת התאקלמות, בעלי חיים הולכים עד סוף הציות במהירויות הליכון שונות ו/או ברמות שיפוע שונות. תגמולי מזון נחוצים לעתים קרובות כדי להשיג מוטיבציה מקסימלית. עם זאת, תוצאות הליכה בהליכון מציעות רק פרשנויות עקיפות לתפקוד התכווצות השרירים בשל מגבלות כגון מוטיבציה של הנושא, גיוס יחידות מוטוריות לא מקסימליות ותלות משותפת מובנית במערכות גוף אחרות כגון מערכות הלב וכלי הדם, השלד והנשימה.
מצד שני, EMG מציע הערכה ישירה מעט טובה יותר של מערכת שרירי השלד, שכן אלקטרודות EMG ממוקמות ישירות על קבוצת השרירים המעניינת 36,37,38. אלקטרודות EMG מודדות את פעילות השרירים הקולקטיבית (סיבי שריר דה-קוטביים). פעילות שרירים זו מבוססת על גיוס יחידות מוטוריות וקידוד קצב (תדירות פוטנציאל הפעולה הנשלח ליחידות מוטוריות מגויסות). עם זאת, הפרדת התרומות היחסיות של גיוס יחידות מוטוריות לעומת קידוד שיעור אינה אפשרית עם EMG פני השטח. יתר על כן, EMG מסתמך על נכונות הנושא ליצור התכווצויות מקסימליות, ורמה זו של שיתוף פעולה אינה סבירה במודלים של בעלי חיים גדולים. בעוד שזה יכול להיות אינפורמטיבי להעריך שינויים ב- EMG במהלך מחזור ההליכה, נתונים אלה אינם מייצגים יכולת תפקודית מקסימלית של קבוצת שרירי השלד המעניינת. הדמיה מבוססת אולטרסאונד המשתמשת במצב B ואלסטוגרפיה של גלי גזירה היא שיטה לא פולשנית נוספת המשמשת להערכת תפקוד השרירים. יש מתאם טוב בין המודולוס של יאנג שנמדד על ידי אלסטוגרפיה לבין הגדלת עומסי השרירים39,40. אלסטוגרפיה של גלי גזירה אומתה ושימשה כמדד כמותי לנוקשות רקמות פסיבית 41,42,43,44,45, כולל במודל פגיעה באובדן שרירים נפחיים חזיריים 23. זה יכול לשמש גם כמדידה עקיפה של ייצור כוח שריר פעיל39. עם זאת, עדיין קיימות מגבלות הדומות ל- EMG לנכונות הנושא ולשיתוף פעולה לביצוע התכווצויות.
פרוטוקול in vivo המתואר כאן, בניגוד למרחק הליכה של הליכון ו- EMG, מספק הערכה אמינה, ניתנת לשחזור ומקסימלית של תפקוד השרירים. פרוטוקול זה מעורר התכווצויות שרירים באופן מבוקר וניתן לכימות שאינו תלוי במוטיבציה. באופן ספציפי, אלקטרודות מלעוריות משמשות כדי לעורר אקסונים עצבים לעקוף את מערכת העצבים המרכזית. דה-פולריזציה של האקסונים העצביים מפעילה את כל היחידות המוטוריות ומבטלת את השונות הקשורה לגיוס יחידות מוטוריות. בנוסף, החוקר שולט בקידוד קצב (תדירות גירוי). הפיזיולוגיה הנוירומוסקולרית המתקבלת החלה על גישה זו מתחילה בהפעלת תעלת נתרן מגודרת מתח בצמתים של Ranvier. כל הפיזיולוגיה הבאה (או במורד הזרם) עוסקת, כולל צימוד עירור-התכווצות ורכיבה על אופניים חוצי גשרים. יתרון משמעותי של ניתוח השרירים הלא פולשניים in vivo הוא שניתן למדוד את תפקוד השרירים המתכווצים שוב ושוב, למשל, מדי שבוע, כדי לעקוב אחר חוזק השרירים לאחר פציעה, התערבות או על התקדמות המחלה.
מגבלות השיטה
ציוד in vivo המתואר בפרוטוקול זה מאפשר מומנט איזומטרי פסיבי ואקטיבי כפונקציה של זווית המפרקים ותדירות הגירוי. מנגנון הבדיקה שבו נעשה שימוש אינו תומך במדידת התכווצויות דינמיות (למשל, התכווצויות אקסצנטריות איזוקינטיות או קונצנטריות קונצנטריות). המנגנון מאפשר טווח תנועה של 105° כדי לאפיין את יחסי זווית המומנט-מפרק ומשתמש בתא עומס עם טווח מומנט מרבי של כ-50 N·m. שאלות ניסיוניות ספציפיות עשויות לדרוש מאפייני ביצועים מחוץ למפרטים אלה. יש לציין כי תא ההעמסה במנגנון המתואר הזה עשוי להיות מוחלף בטווחי מומנט גדולים יותר במידת הצורך.
לפרוטוקול המתואר כאן למדידת חוזק עצבי-שרירי מקסימלי in vivo יש מגבלות בולטות. ראשית, שיטה זו דורשת הרדמה, אשר עשויה להתבצע באופן שונה לפי פרוטוקולים ומשאבים של מתקן בעלי חיים. ידוע כי להרדמה יש השפעות שונות על תפקוד הנוירומוסקולרי והוכח כי הן משנות את ייצור מומנט ה-in vivo dorsiflexor של עכבר באופן מסוג הרדמהותלוי מינון 29. ההשפעות הדיפרנציאליות של חומרי הרדמה על מומנט ה-in vivo של בעלי החיים הגדולים אינן ברורות; לכן, קבוצות בקרה וניסויים חייבות להיות בעלות אותם חומרי הרדמה (למשל, כל הקבוצות שקיבלו קטמין) כדי לשלוט בשונות זו. שנית, ההסתמכות על דפוסי דיפוזיה in vivo מגבילה את חקר המנגנונים התאיים של אין-אונות-אונות של אין-אונות-תפקוד של תרופות מתכווצות ורעילות חריפה של תרופות. לדוגמה, ניתן להשתמש בקפאין במהלך בדיקת אמבטיית איברים במבחנה של שריר מבודד כדי לעורר שחרור סידן של רשתית סרקופלסמית, תוך עקיפת צימוד עירור-התכווצות46 ישירות. כמות הקפאין כדי לגרום לאפקט זה (mM) היא קטלנית בסביבה in vivo . יהיה צורך לקחת בחשבון את השפעות התרופות על כל הגוף (למשל, סטרס בכליות/כבד) ובגורמים הבאים המופרשים למחזור הדם אם גישה זו משמשת לבדיקת תרופות על חוזק שרירים חריף23. שלישית, השימוש בגירוי עצבי חשמלי מקסימלי חורג מאסטרטגיות גיוס וולונטריות, כפי שפורט לעיל, ולכן אינו משקף שינויים בחוזק שעשויים לנבוע מהתאמות גיוס נוירומוסקולריות.
מדידות מומנט In vivo עשויות להיות מוגבלות גם בכל הנוגע להקמת מנגנון ספציפי לתצפיות ניסיוניות. לדוגמה, המומנט על מפרק הקרסול תלוי לא רק בייצור כוח השריר אלא גם בתכונות הגיד והמפרק ורקמות החיבור. יתר על כן, הכוח נוצר על ידי קבוצות של שרירים, במיוחד הפלקסורים הכפיים (שרירי הגסטרוקנמיוס, הסולאוס והפלנטריס) והדורסיפלקסורים (פרונוס טרטיוס, טיביאליס ושרירי דיגיטורום) בחזירים. לכן, פרשנויות של נתוני מומנט in vivo מקסימליים דורשות התייחסות לשינויים פוטנציאליים בשרירים ואנטומיים, והן מוגבלות לקבוצות שרירים, ולא לשרירים בודדים. באופן דומה, קבוצות שרירים מורכבות לעתים קרובות מתערובת של סיבי שריר מהירים ואיטיים בעיקר, כגון שרירי הגסטרוקנמיוס והסולאוס, בהתאמה, של הפלקסורים הכפיים. תכונות התכווצות כגון קצב התכווצות והרפיה (או התכווצות מזמן לשיא וזמן הרפיה למחצה) אינן אינדיקטורים אמינים לפיזיולוגיה של סוג הסיבים באמצעות תכשירי in vivo לעומת שרירים מבודדים, כגון פרוטוקולי בדיקת in vitro או in situ 47. תכשירי שרירים מבודדים עדיפים גם בהבנת ההשפעה של פרמטרים ביומכניים על תפקוד השריר מכיוון שניתן לשלוט במדויק בתכונות כגון אורך השריר; חשוב להדגיש כי יחסי הזווית-מומנט של המפרק אינם שווים באופן ישיר ליחסי אורך-כוח שריר, שכן תכונות הגיד (למשל, רפיון), השריר (למשל, זווית ההצמדה, חפיפת הסרקומר) והמפרק (למשל, זרוע המומנט) התורמים לייצור מומנט תלויים בזווית המפרק. לשם כך, ניסויים פונקציונליים גדולים של בעלי חיים באתרם 48 יכולים להיות תוספת רבת ערך לבדיקות in vivo, תוך התחשבות בכך שבדיקת in situ היא ניסוי סופני. חידושים אחרים לפרוטוקול הנוכחי שעשויים להיחקר בעתיד כדי לשפר את התובנה המכניסטית של ממצאי הניסוי כוללים שימוש בהדמיית מצב B של אולטרסאונד למדידת תכונות אדריכליות של שרירים וגידים והשתלת מתמר כוח גיד למדידת כוח שריר במהלך התכווצויות רצוניות ומעוררות חשמלית49.
חשיבות ויישומים פוטנציאליים של השיטה
פרוטוקול זה מעריך את יכולת ייצור המומנט in vivo של קבוצת השרירים החזירית דורסיפלקסור, ומדגים שיטה לא פולשנית להערכת רווח או אובדן תפקוד שרירים בסביבה פיזיולוגית. מכיוון שהמתודולוגיה אינה סופנית לחזיר, ניתן להשתמש בה גם כדי להעריך את תפקוד השרירים באותם נושאים לאורך במהלך התקדמות המחלה, או לפני, במהלך ובעקבות אסטרטגיית טיפול. ככזה, תכנון ניסויי מדידות חוזרות ונשנות עשוי לאפשר השוואות סטטיסטיות חזקות עם כוח רב יותר ופחות בעלי חיים בהשוואה למדדים בלתי תלויים. בנוסף, תפקוד לקוי של שרירי השלד הוא מרכיב בולט בתהליכי מחלה ומצבים שונים, כגון בזבוז שרירים הקשור למחלות כרוניות (למשל, אי ספיקת לב, אי ספיקת כליות, איידס, סרטן וכו ‘), ניוון שרירים, מחלות נוירודגנרטיביות (למשל, SMA או טרשת אמיוטרופית צידית; ALS), הזדקנות (כלומר, סרקופניה), ורעילות לסמים. היכולת התפקודית של שרירי השלד היא מדד תוצאה ראשוני קריטי להתערבויות כגון פעילות גופנית, תזונה וטיפולים תרופתיים ותרופות רגנרטיביות. לפיכך, הפרוטוקול המתואר כאן כדי להעריך באופן מהימן את כושר ייצור המומנט החזירי in vivo עשוי לשמש ביישומי מחקר רבים. זה עשוי להיות חיוני ברכישת נתונים נרחבים על בעלי חיים לתרגום של טיפולים מתפתחים.
The authors have nothing to disclose.
העבודה והנתונים שהוצגו נתמכו באופן נרחב על ידי פיקוד המחקר הרפואי והחומרים של צבא ארה”ב ל-BTC ול-SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); והמחלקה לענייני חיילים משוחררים, מינהל בריאות ותיקים, משרד המחקר והפיתוח (I21 RX003188) ל- JAC ולד”ר לוק ברוסטר. המחברים מודים בהכרת תודה על השירות הווטרינרי של USAISR וענפי הפתולוגיה ההשוואתית ועל מרכז ההדמיה הפרה-קלינית המתקדם של UMN על הסיוע הטכני בהשלמת מחקרים אלה.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |