Produção de camundongo humanizado por meio de enxerto de cápsula renal tímica, injeção de células CD34+ e entrega de citocinas

Resumo

Modelos de camundongos humanizados fornecem uma representação mais precisa do microambiente imunológico humano. Este manuscrito descreve o processo no qual esses modelos são criados por meio de um enxerto renal de timo humano, injeção de células CD34⁺ humanas e a entrega direcionada de transgenes de citocinas humanas para promover a proliferação e diferenciação de células CD34⁺ .

Resumo

Os modelos animais fornecem uma tradução vital entre a pesquisa biomédica in vitro e in vivo . Modelos de camundongos humanizados fornecem uma ponte na representação de sistemas humanos, permitindo assim um estudo mais preciso da patogênese, biomarcadores e muitas outras consultas científicas. Neste método descrito, camundongos IL2Rγnull (NSG) com NOD-scid imunodeficiente são implantados com timo autólogo, injetados com células CD34⁺ derivadas do fígado, seguidas por uma série de entregas de citocinas injetadas. Em contraste com outros modelos de natureza semelhante, o modelo descrito aqui promove uma reconstituição aprimorada das células imunes, fornecendo citocinas e fatores de crescimento por meio de transgenes codificados em vetores baseados em DNA AAV8 ou pMV101. Além disso, oferece estabilidade a longo prazo com camundongos reconstituídos com uma vida útil média de 30 semanas após as injeções de CD34⁺ . Por meio desse modelo, esperamos fornecer um método estável e impactante de estudo de imunoterapia e doenças humanas em um modelo murino, demonstrando assim a necessidade de modelos pré-clínicos preditivos.

Introdução

Embora os modelos animais tenham criado uma compreensão mais profunda dos sistemas celulares e moleculares, o desafio permanece em elucidar as complexidades dos sistemas específicos da espécie, como imunidade, fisiologia e outras áreas da patologia. Primatas não humanos (NHP), como chimpanzés, têm sido historicamente usados para compensar as lacunas na pesquisa de modelos; no entanto, o modelo de PNH pode ser bastante caro e inacessível, principalmente porque seu uso foi proibido na Europa¹.

Após um procedimento de enxerto bem-sucedido, o sistema murino replica o sistema imunológico ....

Protocolo

Todos os protocolos que envolvem o uso de animais são monitorados de perto pelo Comitê Institucional de Cuidados e Usuários de Animais (IACUC) do Instituto Wistar. O laboratório segue as diretrizes estabelecidas por este comitê e pelo veterinário assistente para garantir a saúde, segurança e bem-estar dos animais envolvidos. Antes de seguir este protocolo, é necessária a aprovação do veterinário e da IACUC, e os indivíduos podem ter variações nas técnicas cirúrgicas específicas e no manejo dos animais em comparação com o protocolo, de acordo com o conselho das partes envolvidas no bem-estar animal.

NOTA: As....

Resultados

Após cirurgia bem-sucedida e injeções pós-operatórias apropriadas, a diferenciação de CD34⁺ pode ser confirmada por citometria de fluxo. Aproximadamente 8 semanas após a cirurgia, os camundongos são sangrados em preparação para FACS, recorrendo a cada 2 semanas até que um limite específico de células imunes humanas seja atingido, conforme descrito anteriormente¹⁰. Resumidamente, 100 mL de sangue foram coletados em tubos de coleta de sangue revestidos com lítio e heparina. Após a lise do.......

Discussão

Este manuscrito descreveu a geração de camundongos humanizados por meio de timo fetal humano enxertado sob a cápsula renal e subsequente injeção de CD34⁺ para recriar um sistema imunológico humano.

Embora o protocolo funcione para criar o melhor modelo possível, certas etapas são essenciais para a viabilidade. Por exemplo, durante o isolamento CD34⁺ , é essencial que alguém olhando ao microscópio possa identificar células CD34⁺.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de coleta de sangue	Microcontainer	BD
	Life Technologies Corporation
Life	Technologies Sigma	B2635-25g	Medicamento irradiante; kit de
Miltenyi Biotec	130-046-702	CD34	armazenado a 4 ° C
CKIT	Aldevron	citocina personalizada	; armazenada a -20 ° C
Colagenase / Dispersão	Roche Diagnostics 11097113001		Armazenado a 4 > C
FcR Reagente de bloqueio	Miltenyi Biotec	130-046-702	kit de grânulos de anticorpos; armazenado a 4 ° C
Tecido fetal (fígado e timo)	Recursos		Entregue no mesmo dia ou durante a noite
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	Armazenado em temperatura ambiente
FLT3	Aldevron	125964	citocina; armazenado a -20 ° C
Fórceps	Vários	Vários Agulha
de seringa Hamilton	Vários	Vários 22	G; 3 pontos; 2" de comprimento
Hemostáticos	Vários	Várias
colunas MS	Miltenyi Biotec	130-042-201	separador magnético
PBS	Gibco	14190-136	Armazenado à temperatura ambiente
Primocin	Antibiótico Invivogen	amt-pm1	; armazenado a 4 & C
RPMI	Corning	10-040-CM	Armazenado a 4 ° C
SCF	Aldevron	125962	citocina; armazenado a -20 ° C
Tesoura cirúrgica	Vários	Vários
THPO	Aldevron	125963	citocina; armazenado a -20 ° C
Placa de Petri tratada com tecido	Corning	430167
cola VetBond	cola 3M	1469SB	cola
Viseira sutura	Stoelting Co	5046	sutura absorvível, tamanho 4, corte de 19 mm

BD da esferas de anticorpo sensível à luz; avançados de biociência