Vävnadsberedningstekniker för kontrastförbättrad mikrodatortomografiavbildning av stora däggdjurshjärtmodeller med kronisk sjukdom

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att få högupplösta mikrodatortomografibilder av friska och patologiska stora däggdjurshelhjärtan med kollagenselektiv kontrastförbättring.

Abstract

Strukturell ombyggnad är en vanlig följd av kroniska patologiska påfrestningar som åläggs hjärtat. Att förstå de arkitektoniska och kompositionella egenskaperna hos sjuk vävnad är avgörande för att bestämma deras interaktioner med arytmiskt beteende. Ombyggnad av vävnad i mikroskala, under den kliniska upplösningen, framstår som en viktig källa till dödlig arytmi, med hög prevalens hos unga vuxna. Utmaningar kvarstår när det gäller att uppnå hög bildkontrast vid tillräcklig upplösning i mikroskala för prekliniska modeller, såsom stora däggdjurshela hjärtan. Dessutom saknas fortfarande vävnadssammansättningsselektiv kontrastförbättring för tredimensionell högupplöst avbildning. Icke-destruktiv avbildning med mikrodatortomografi visar löfte för högupplöst avbildning. Målet var att lindra lidandet av röntgen över dämpning i stora biologiska prover. Hjärtan extraherades från friska grisar (N = 2) och får (N = 2) med antingen inducerad kronisk hjärtinfarkt och fibrotisk ärrbildning eller inducerad kronisk förmaksflimmer. Utskurna hjärtan perfuserades med: en saltlösning kompletterad med ett kalciumjonkylningsmedel och en vasodilator, etanol i seriell uttorkning och hexametyldisilizan under vakuum. Den senare förstärkte hjärtstrukturen under lufttorkning i 1 vecka. Kollagendominerande vävnad var selektivt bunden av ett röntgenkontrastförbättrande medel, fosfomolybdinsyra. Vävnadskonformationen var stabil i luft, vilket möjliggjorde långvariga mikrodatortomografiförvärv för att erhålla högupplösta (isotropa 20,7 μm) bilder. Optimal kontrastmedelsbelastning genom diffusion visade selektiv kontrastförbättring av epitelskiktet och subendokardiella Purkinje-fibrer i friska grisventriklar. Förmaksflimmer (AF) hjärtan visade förbättrad kontrastackumulering i de bakre väggarna och bilagorna i förmaken, tillskrivet större kollageninnehåll. Hjärtinfarkt hjärtan visade ökad kontrast selektivt i regioner med hjärtfibros, vilket möjliggjorde identifiering av sammanvävda överlevande myokardiella muskelfibrer. Kontrastförbättrade lufttorkade vävnadspreparat möjliggjorde avbildning i mikroskala av det intakta stora däggdjurshjärtat och selektiv kontrastförbättring av underliggande sjukdomsbeståndsdelar.

Introduction

Strukturella hjärtsjukdomar står för majoriteten av hjärtrelaterad dödlighet i hela världen¹. Ombyggnad av hjärtstrukturen påverkar myokardmiljön och det interstitiella utrymmet. Eftersom både hjärtelektrisk och mekanisk funktion beror på myocytorganisation kan störningar leda till oacceptabel hjärtarytmi, nedsatt blodpumpande åtgärder och hjärtsvikt 2,3,4,5,6,7,8,9. Utvecklingen av botande terapier för strukturella hjärtsjukdomar uppvägs långt av sjukdomsprevalensen ^2,5. Som sådan växer ett ökande antal prekliniska modeller av strukturella hjärtsjukdomar fram för att bättre förstå de anatommorfologiska profilerna och den resulterande patogenesen av hjärtarytmier 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. Observerad över det strukturella sjukdomsspektrumet är uppregleringen av interstitiell fibros och, vanligare i ischemirelaterade fall, myokardiell ersättning med fibros och fettvävnad¹⁸. Morfologisk förståelse av patologiska extracellulära komponenter kan möjliggöra identifiering av potentiella substrat av arytmi. Sjukdomens fördelning och omfattning ger starka indikatorer på arytmogen risk. Ändå kvarstår utmaningar för att på ett heltäckande sätt avbilda sjukdomsprofiler genom att integrera makro- och mikroskalor i det intakta hjärtat.

Mikrodatortomografi (microCT), baserad på röntgenstrålar, växer fram som ett kraftfullt verktyg för att förhöra mjukbiologisk vävnadsmikrostruktur med hjälp av kontrastmedel. Mycket detaljerade anatomiska kartor har erhållits för hjärtan från små gnagare 24,25,26 och små dissekerade prover från stora däggdjurshjärtan ^27,28. Avbildning på hela organnivån av stora däggdjurshjärtan ger emellertid alltför långa väglängder över vilka röntgenfotoner dämpas med hjälp av konventionella vävnadsberedningstekniker. Detta innebär kontrastbelastning av vävnaden och nedsänkning av provet i ett kontrastmedel lösningsmedel under förvärvet. Att öka provstorleken och upplösningen innebär en förlängning av den totala förvärvstiden. Därför blir vävnadsstabilitet avgörande för användbar bildrekonstruktion, vilket innebär att vävnadsdeformation till följd av torkning måste förhindras. Användningen av en nedsänkningsvätska har emellertid nackdelar: (i) den totala bakgrundssignalintensiteten blir icke försumbar och (ii) främjar utspädning av vävnadsbundna kontrastmolekyler. Båda dessa faktorer bidrar till att sänka bildkontrasten.

Denna studie beskriver en ny vävnadsbehandlingsrörledning för att lindra bakgrundsfotondämpning och optimera det dynamiska omfånget som erbjuds av kontrastförbättringsmedel. Det föreslås att man använder en vävnadslufttorkningsmetod med kemisk vävnadsförstärkning för att begränsa vävnadsdeformation²⁹. Därför kan vävnadsprover förbli stabila i luften för långa förvärv och utelämna bakgrundsbidrag från nedsänkningsvätskor. Denna metodpipeline ger: (i) ett omfattande vävnadsbehandlings- och avbildningsprotokoll optimerat med hela grishjärtan; ii) en utvärdering av kontrastkoncentrations- och belastningstekniker och iii) tillämpning av denna pipeline i två distinkta modeller av kronisk sjukdom för förmaksflimmer och hjärtinfarkt i fårhjärtan. Utvecklingen av modellerna för kronisk sjukdom har beskrivits på annat håll för varje kronisk hjärtsjukdomsmodell, hjärtinfarkt inducerad av perkutan kranskärlsembolisering¹³ och självförsörjande förmaksflimmer³⁰.

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna i Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål. Djurprotokoll godkändes av den lokala etiska kommittén (CEEA50) vid universitetet i Bordeaux. Hjärtan hämtades från tre stora däggdjursmodeller, inklusive (i) Friska stora vita grisar (N = 2, 2 månader gamla); (ii) Får (N = 1, 2 år) med inducerad hjärtinfarkt13 och (iii) Får (N = 1, 7 år) med inducerad förmaksflimmer30. 1. Beredning av lösning: Kardioplegisk lösning: Bered 3 liter destillerat vatten och tillsätt natriumklorid (110 mM), kaliumklorid (16 mM), natriumbikarbonat (10 mM), D-(+)-glukos (9 mM), kalciumkloridlösning (1,2 mM) och magnesiumkloridlösning (16 mM). Tillsätt i slutet 500 μl /l heparinnatrium. Bevara denna lösning vid 4 °C. Fosfatbuffrad saltlösning – EDTA-lösning (PBS-EDTA). Tillsätt först etylendiamintetraättiksyra (EDTA) till 1 liter destillerat vatten för en slutlig koncentration av 10 mM. Öka och behåll en lösning pH på 12 med natriumhydroxidlösning (1 M) för att lösa upp EDTA. När EDTA är helt upplöst sänker du pH-värdet till 7,4 med saltsyra. Tillsätt en foliepåse med fosfatbuffrad saltlösning för att erhålla en lösning vid 0,01 M (natriumklorid, 0,138 M; kaliumklorid, 0,0027 M) och pH 7,4. Spara denna lösning vid rumstemperatur (RT). Etanol – fosfomolybdinsyra (PMA) kontrastmedelslösning: Förbered 1 liter absolut etanol och tillsätt PMA för att erhålla en lösning vid 1% av koncentrationen. Spara den här lösningen på RT. 2. Vävnadens källa Avliva djuret och extrahera hjärtat enligt lokala etiska riktlinjer. Sänk snabbt ner hjärtat i kall kardioplegisk lösning och massera försiktigt ventriklarna för initial sköljning. Se till att skära aortan under aortabågen och kläm fast två sidor av artärväggen med nålhållare. Häng upp hjärtat med nålhållarna, sätt in en aortakanyl i aortaroten, var försiktig så att du inte kommer i kontakt med eller sticker ut genom aortaklaffarna. Vik en 0 gauge sutur runt aortabågen i nivå med kanylen och knyt fast kanylen på plats. Använd 50 ml sprutor och injicera 200 ml kall (4 °C) kardioplegisk lösning. Ta bort överflödigt blod som samlas i hålrummen genom att tippa hjärtat på dess bakre sida för att rinna av via lungvenerna. Sänk ner det sköljda hjärtat och förvara i kall kardioplegisk lösning lagrad på is tills den är klar för dissektion. 3. Vävnadsberedning: Förbered en 1 L behållare som stöds 80 cm ovanför en dissektionsskål. Koppla ett termoplastiskt rör 80 cm i längd och 3,2 mm innerdiameter och 4,8 mm ytterdiameter till en avloppsport i behållaren. Fäst en trevägskran på dräneringsslangen och koppla ytterligare termoplastslangar (20 cm, 1,6 mm innerdiameter och 3,2 mm ytterdiameter) till varje fri port på trevägskranen. Fixa tvåvägskranar till slangens avgiftsändar. Fyll behållaren med den kardioplegiska lösningen kompletterad med heparin (2500 enheter). Öppna kranarna så att den kardioplegiska lösningen kan rinna av och ta bort alla luftbubblor och stäng sedan tvåvägskranarna. Förbered kanyler för vänster och höger koronar ostia med polytetrafluoretylen (PTFE) slang (1 mm innerdiameter och 2 mm ytterdiameter). Skär 5 cm slang och värm ena änden genom att placera spetsen bredvid en öppen låga. När 1 mm av spetsen börjar smälta och blir genomskinlig, tryck spetsen mot en hård värmebeständig yta för att forma en ås vid kanylspetsen för att förhindra att kanyler glider ut ur kärlen. Sätt in 1 cm av den icke uppvärmda änden av varje kanyl i de två ändarna av avloppsbehållarens dräneringsrör. Ta bort aortakanylen. Under kall kardioplegisk lösning, lokalisera vänster och höger ostia av kranskärl. Använd spetsig sax och separera försiktigt aortaroten från den omgivande vävnaden ovanför och under koronar ostia för att möjliggöra gängning av en 0 G silkesutur under kranskärlet. Öppna tvåvägskranarna och sätt in kanylspetsarna i kranskärlen ostia. Med kanylspetsarna som sträcker sig 1-2 cm in i ostia och bortom suturplaceringen, knyt av kanyler. Skölj hjärtat medan du masserar ventriklarna försiktigt i 15 minuter tills hjärtat rensas från blod. Efter sköljning stänger du tvåvägskranarna och kopplar bort dem från trevägskranen. Överför hjärtat till en 1 L kemikalieresistent plastbehållare som innehåller 500 ml PBS-EDTA-lösning. Återcirkulera PBS-EDTA-lösningen i termoplastslangen under en dragskåp med en peristaltisk pump med två kanaler. Fyll pumpröret tills slangen saknar luftbubblor och genomsyra sedan varje kranskärlskani genom återcirkulation vid RT i 2 timmar vid 80 ml/min. Se till att dragskåpet är i drift. Stoppa pumpen, töm lösningen från behållaren och byt ut den mot formalin (10%) för fixering i 1 timme vid RT vid 80 ml/min. Byt ut formalinlösningen mot PBS för att skölja fixeringsmedlet tre gånger i 15 minuter vardera vid 80 ml/min. 4. Vävnadsuttorkning och torkning: OBS: Använd samma perfusionshastighet (80 ml / min) och låt vävnaden förbli vid RT hela tiden. Byt ut PBS-lösningen mot etanol vid 20%, utspädd i ultrarent vatten och perfuse i minst 3 timmar. Perfuse hjärtat med hjälp av en serie ökande etanolkoncentrationer. Börja med att ersätta 20% etanollösning med etanol utspädd till 30% och perfuse i 2 h. Upprepa perfusionen genom att öka etanolkoncentrationen vid varje iteration genom 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 95%, 90%, 95%, 99% och 100% under en minsta varaktighet av 1 h vid varje steg (koncentration).OBS: Hjärtprover kan vila utan perfusionsflöde över natten vid eventuell etanolutspädning om minsta perfusion på 15 min har ägt rum för den koncentrationen. VALFRITT: Om du applicerar kontrastmedel via perfusion, perfusera hjärtat med 100% etanol kompletterat med kontrastmedlet PMA, 1% i 48 timmar. Skölj kontrastmedlet genom perfusion med 100% etanol i 2 timmar. För att förstärka hjärtvävnaden före lufttorkning, återcirkulera en 50:50 blandning av etanol och hexametyldisilazan (HMDS) i 10 minuter. Följ detta med 100% HMDS i ytterligare 2 timmar.VARNING: HMDS är ett mycket giftigt och skadligt ämne. En stark lukt av ammoniak frigörs i kontakt med luft. Dessutom är den flytande formen av HMDS mycket flyktig och katalyseras av jodinnehållande medel. Koppla bort kanylerna från slangen och häng upp hjärtat från en aorta sutur inuti dragskåpet. Skjut försiktigt en blixtlåspåse över hjärtat och stäng påsförseglingen över suturen för att minska hjärtats exponering för cirkulerande luft. Låt hjärtat torka genom avdunstning i 1 vecka. VALFRITT: För diffusionsladdande kontrastmedel, tvätta hjärtat i 100% etanol i 15 minuter medan du rör om. Sänk ner hjärtat i 100% etanol kompletterat med PMA, 1%, i 48 h under vakuum. Upprepa steg 4.6. 5. MikroCT: OBS: Ett stationärt röntgenmikroCT-system användes för att avbilda grishjärtan. Montera det lufttorkade hjärtat på en lämplig provhållare. Förhindra rörelse under röntgenmikroCT-mätningarna med hjälp av en klämma förankrad i provhållaren och säkra hjärtat via den torkade och styva aortan. Rikta noggrant in mitten av hjärtprovet längs dess längsgående axel med mitten av bildfältet för 0 ° och 90 ° rotationsvinklar. För att uppnå detta i alla riktningar, häng upp hjärtat i luften via en aortaklämma fäst vid provstödet. Efter att ha öppnat programvaran och initierat röntgenmikroCT-systemet, applicera röntgenfiltret aluminium, 1 mm, röntgenkällspänning till 60 kV och ström till 120 μA. Ställ in bilddimensioner till 2016 x 1344 pixlar och pixelstorlek till 20 μm. Dra ut provhållaren ur synfältet och kalibrera bakgrundsbilden och röntgenexponeringstiden genom att få en korrigering med platt fält. Se till att den genomsnittliga bakgrundsröntgenöverföringen är större än 80%. Scouta röntgenöverföringsbilder längs stödets längd för att bestämma det totala bildfältet i hjärtats längdaxel. För skanning, använd ett rotationssteg på 0,18 °, en ram i genomsnitt på 5 och en provrotation på 180 °. Välj förskjutningsskanningsläget för att avbilda hela bredden på exempelstödet.OBS: Förvärvsparametrarna som anges i detta avsnitt har valts för att optimera bildkvaliteten på ensemblehjärtkompositionen. Efter skanning, använd programvaran för tomografisk rekonstruktion av en isotrop tredimensionell bildvolym. För tillämpning av NRecon-programvara, använd förvärvsrelaterad artefaktkorrigering, inklusive strålhärdande effekter på 10% och ringartefaktreduktion på 8. Om du vill optimera datalagringsbegränsningarna använder du det minsta rektangulära område som omfattar hjärtspecifika bildvoxlar. Exportera bilderna i ett 8-bitars bitmappsformat som en bildstapel. Visualisera den rekonstruerade datastacken med hjälp av DataViewer-programvaran. Orientera provet digitalt inom bildgränserna för att justera provets långa och korta axlar med de tre huvudaxlarna i bildvolymen. Beskär bildvolymen i alla tre axlarna för att ta bort yttre bakgrundslager i bilden för att maximalt minska den totala bildstorleken.

Representative Results

Beredningen av stora däggdjurshjärtan med hjälp av uttorknings- och lufttorkningsmetoden tar bort allt vatteninnehåll från provet. Tecken på otillräcklig vattenersättning med etanol kan observeras under HMDS-belastning (se protokoll, steg 4.4). Närvaron av vatten under HMDS kommer att skapa bubblor som stiger upp från vävnaden. Vid alltför höga vattennivåer kan en ökning av nedsänkningsvätskans temperatur uppstå. Att hålla nedsänkningskammaren omgiven av is under den första HMDS-belastningen kan minska skadeverkningarna av vävnadsuppvärmning. Efter lufttorkning av hjärtan i frånvaro av kontrastmedel kommer provet att visas vitt i färg (se protokoll, steg 4.6). Den yttre ytan var ofta torkad och strukturellt stabil före intramurala skikt. Sköljning i etanol före laddning av kontrastmedel avlägsnade den vita avsättningen (se protokoll, steg 4.7). Skivning genom vävnad med ett skarpt blad avslöjar makroskopiskt individuella muskelfibrer med tydlig separation. Kontrastbelastning genom att nedsänka hjärtprover i kontrastmedelsmedium led av diffusionsgränsartefakter i tjocka och mycket muskulösa regioner i provet. Diffusionskontrastbelastning under vakuum gav mer homogen färg i muskler (hjärtprov #1, se tabell 1 för laddningstider för kontrastmedel). Makroskopiskt visade fördelningen av ytkontrastmedel inhomogen färgning mellan hjärtmuskeln och regioner som huvudsakligen består av extracellulära komponenter, särskilt fett och bindväv. Lufttorkade vävnadsprover, antingen före eller efter laddning av kontrastmedel, bibehöll stabil strukturell integritet. Den tid som krävdes för att skanna provets hela bredd vid 20 μm upplösning under microCT med hjälp av ovannämnda skanningsparametrar och en exponeringstid på 1700 ms var 6 timmar och 34 min. Beroende på provets storlek i skannerns portalaxel multiplicerades denna varaktighet med antalet positioner som behövdes för att fånga provets fulla längd. För gris- och fårhjärtan i denna studie användes tre till fyra positioner. NRecon-programvaran kaklade multipositions- och offsetskanningarna för att bilda en enda röntgenprojektionsbild för varje rotationssteg i röntgenkällan och detektorn. Totalt lagras 1000 projektioner som 16-bitars bilder, vilket genererar 30-40 GB data. Rekonstruerade volymetriska bilder var 52-70 GB. Viktiga anatomiska landmärken, inklusive ventrikelhåligheterna, septum och fria väggar i ventriklarna, var lätt identifierbara från röntgenöverföringsavbildning av lufttorkade grishjärtan färgade med kontrastmedel genom diffusionsbelastning (figur 1A). Dessutom observerades också mycket strukturerade regioner som indikerar mikrostrukturell organisation, såsom myokardiell fiberorientering, på grund av känslig röntgendämpning / överföring (Figur 1B). Tomografiska rekonstruktioner av tredimensionella bildvolymer visade tydlig separation mellan vävnad och bakgrund vid både epikardiella och endotelgränser (figur 1D). Intramuralt observerades diffusionsgradient med låg kontrast och voxelintensitet genom tjocka transmurala regioner i vävnaden. Trots det var kärl- och myokardfibrer separerade av klyvningsplan fortfarande lätt identifierbara. En andra högre intensitetsbandbredd av kontrast observerades vid det epikardiella lagret och i punkterade subendokardiella regioner. Kontrastförbättringen var störst på platser där extracellulära komponenter ackumulerades, särskilt epikardiell bindväv, epikardiellt fett och bindvävsmanteln i Purkinje-fibernätverket. Voxel-signalintensitetsfördelningar visade hög separation från nollintensiv bakgrund (luft) och två dominerande populationer av vävnad med låg och hög kontrast (figur 1D). För att validera kontrastförbättring av mikroCT-bildrekonstruktioner och selektiviteten till kollagena fack i hjärtproverna användes histologi, ljusfältmikroskopi och fluorescerande mikroskopi (figur 2). Ett transmuralt block av ventrikulär vävnad från ett lufttorkat hjärta utan föregående kontrastmedelsbelastning förbereddes för paraffininbäddning och sektionering. Intilliggande vävnadsskivor monterade på mikroskopglas behandlades med antingen Massons trikromfärgning, ingen behandling eller 48 h PMA (1%). Nedsänkning av glidmonterade vävnadssektioner eliminerade diffusionsgradienteffekter av färgningsprocessen som observerades i hela hjärtprover. Masons trikromfärgning visade kollagenpositiv färgning vid epitel- och endotelskikten, perivaskulärt i subemikardiell vävnad och en bindvävsmantel som omger en fritt rinnande Purkinje-fiber som sticker ut i vänster ventrikulär hålighet (Figur 2A). Ljusfältbelysning visade mörkare färg i kollagena strukturer efter PMA-färgning, vilket stöder den förmånliga ackumuleringen av PMA (figur 2B, C). Dessutom har PMA-behandling tidigare visat sig släcka autofluorescensen av kollagenmakromolekylära komplex31. Fluorescerande bilder av ventrikulära vävnadssektioner hade PMA-inducerad förlust av fluorescens vid kollagenställen (figur 2D vs. 2E, figur 2D ‘vs. 2E’ och figur 2D ” vs. 2E ”). Vid både ljusfält och fluorescerande avbildning förändrades inte cellulära fack av PMA-behandlingen, och kollagen hade en selektiv ackumulering av PMA-färgning och släckning av autofluorescens. Hjärtprov #2 färgades med ett kontrastmedel via perfusion före lufttorkning. Bildrekonstruktion avslöjade mycket fläckig färgning i myokardfacket (figur 3A). Kontrastförbättring verkade icke-selektiv av vävnadskompositionen, utan ytterligare förbättring av signalintensiteten vid de epikardiella eller subendokardiella regionerna. Dessutom visade vävnad med låg kontrast dålig separation från bakgrundsintensiteten (figur 3B). Ventrikelfibros inducerades av hjärtinfarkt och kronisk ischemi (Hjärtprov #3). Ett antero-apikalt ärr bildades genom att ersätta myocyter med fibrofettavlagringar i vävnaden nedströms till platsen för vaskulär embolisering. Hjärtprov #3 framställdes och avbildades från en dissekerad ventrikulär kil som täckte den främre vänstra ventrikeln, septum och höger ventrikelfri vägg. Beredningen av denna ventrikulära kilkonfiguration har beskrivits tidigare32 och tillämpningen av kilar för hjärtavbildning granskades i detalj33. Ärrmorfologin var transmural men heterogen (figur 4). En central tät fibrotisk lesion omgavs av en lös och heterogen gränszon (figur 4A). Det ventrikulära preparatet färgades genom diffusionsbelastning efter lufttorkning och i vakuum. Figur 4B-E visar de största signalintensiteterna hos rekonstruerade mikroCT-bildvolymer vid vävnadsgränserna och ärrregionerna. Kontrastmedel färgade dåligt friskt myokardium, men mikrostrukturell kontrast behölls (figur 4C ‘). I gränszonen varvades ärrvävnad med överlevande myokardium (figur 4D’). Tät fibros verkade transmural men ändå strukturerad, vilket indikerar variationer i kompositionen (figur 4E ‘). Vävnadssektioner i en transmural vänsterkammarregion i det lufttorkade och PMA-färgade vävnadspreparatet användes för att validera PMA-selektivitet för kollagen i patologisk vävnad genom att jämföra med Massons trikromfärgning (figur 4F). PMA-färgning var selektiv för kollagen (sub-epikardium och sub-endokardium) och frånvarande i regioner med överlevande myokardium (figur 4G). Hjärtprov #4 med inducerat ihållande förmaksflimmer lufttorkades samtidigt som den ursprungliga formen på förmakshålan bevarades. Förmaksbihangskollaps observerades inte. De viktigaste anatomiska landmärkena kunde identifieras morfologiskt från rekonstruerade bilder (förmaksseptum, pektinatmuskler, koronar sinus, lungven ostia, vena cava och cristae terminalis). Diffusionsfärgning under vakuum resulterade i kontrastförbättring i aortaroten och atrioventrikulära ventiler och diskreta regioner i det arbetande myokardiet. Muskelfärgningsförbättring begränsades till förmaksbihang och bakre väggar i både vänster och höger förmak (figur 5). Figur 1: MicroCT-avbildning av ett lufttorkat grishjärta behandlat med PMA-kontrastmedel genom diffusion under vakuum. (B) En transmissionsprofil extraherad från den röda linjen i A. (C) Kortaxelskiva av ventriklarna från en tomografiskt rekonstruerad tredimensionell volym. Gula pilar indikerar punkterade kontrastregioner som tillskrivs subendokardiella Purkinje-fibrer. Blå pilar indikerar vaskulatur. (D) Signalintensitetsfördelning för det rekonstruerade bildsegmentet som visas i C. LV: vänster kammare och RV: höger kammare. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: Validering av PMA-selektivitet för kollagen. Myokardium är färgat i rött och kollagen visas med grön färg. Intilliggande vävnadssektioner (B) utan färgning eller (C) färgade med PMA (1%) avbildades med stark fältbelysning för att bedöma färgens enhetlighet. (D) Vävnadssektioner som saknade färgning eller (E) färgade av PMA avbildades med fluorescerande mikroskopi. Panelerna D’ (solid röd ruta) och E’ (streckad röd ruta) är förstorade vyer av undereokardiet för ofärgade och PMA-färgade sektioner. Panelerna D” (solid blue box) och E” (streckad blå låda) är motsvarande förstorade vyer av subendokardiet och en fritt rinnande Purkinje-fiber. Pilar indikerar platser med kollageninnehåll. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: Perfusionsbelastning av PMA före lufttorkning och MicroCT-avbildning. Blå pilar indikerar vaskulatur. (B) Signalintensitetsfördelningen för bildsegmentet från panel A. LV: vänster kammare och husbil: höger kammare. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4: MicroCT-avbildning av ett fårhjärta som lider av ett kroniskt hjärtinfarkt. En volymåtergivning av det apikala området ur ett endokardiellt perspektiv tilldelades färg baserat på bildintensitet (rött motsvarande ärrvävnad och myokardium i grönt). Ortogonala skivor av gråskaleintensiteten visar den täta ärrfördelningen och gränsande överlevande myokardiet. Separation mellan fibrotisk vävnad och myokardium motsvarar regioner av fettvävnad. (B) Ett fotografi av ett lufttorkat ventrikelkilpreparat från ett får med apikal ärrbildning efter hjärtinfarkt. Sneda skivor av den rekonstruerade mikroCT-bildvolymen korsar ventriklarna på mellannivå mellan bas och topp och proximal till platsen för (C) vaskulär ocklusion (C- röd linje i panel B), (D) periinfarktregionen som gränsar till tätt ärr och friskt myokardium (D- blå linje i panel B) och (E) ett område med tät fibros (E – grön linje i panel B). (C’) En utökad vy av septalregionen som skisseras av en röd streckad ruta i C. (D’) En utökad vy av infarktområdet i höger ventrikulär topp (blå streckad ruta i panel D). (E’) En utökad vy av infarktområdet i vänster ventrikulär topp (grön streckad ruta i panel E). LV: Vänster ventrikulär hålighet; RV: höger ventrikulär hålighet; MB: moderatorband; Pap: papillär muskel. Gul pil indikerar vänster främre fallande artär. (F) Massons trikromfärgning av en histologisk sektion skuren från den PMA-färgade lufttorkade vänsterkammaren. Kollagen färgas blått och myokardiet är färgat rosa/violett. (G) En motsvarande vävnadsdel av PMA-färgningsfördelningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: MicroCT-bild av ett fårhjärta efter kronisk inducerad förmaksflimmer. (B) Bi-förmaksmikroCT-bildskiva i hjärtats långaxel. Kortaxliga skivor extraherades på nivån av (C) atrioventrikulära ventiler (C- röd linje i panel B), (D) aortarot (D- blå linje i panel B) och (E) vänster förmakstak (E- grön linje inpanel B). LA: vänster förmak; RA: höger förmak; LAA: vänster förmaksbihang; RAA: höger förmaksbihang; LV: vänster kammare; RV: höger kammare; LVOT: vänster ventrikulär utflödeskanal; RVOT: höger ventrikulärt utflöde och PA: lungartär. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Prov # 1 2 3 4 Art Gris Gris Får Får Kroppsvikt (kg) 32.4 31.2 47.2 53.4 Hjärtvikt (g) 191.2 186.2 202.4 207.6 Patologi – – Kronisk MI Kronisk AF Beredning av prov Hela hjärtat Hela hjärtat Kil av främre hjärta Hela hjärtat Läge för kontrastbelastning Diffusion Perfusion Diffusion Diffusion Exponering av kontrastmedel (h) 48 24 48 48 Tabell 1: Hjärtprover och behandling av kontrastmedel.

Discussion

Ett detaljerat protokoll för stora vävnadspreparat anges med hela hjärtan från stora däggdjur för efterföljande högupplöst strukturell avbildning. En lufttorkningsmetod tog bort influenser av bakgrundsröntgendämpning och maximal optimering av vävnad: bakgrundskontrast²⁹. Med hjälp av detta tillvägagångssätt uppnåddes en isotrop upplösning i intervallet 20 μm för volymetrisk avbildning över prover upp till 7,2 cm i diameter. MikroCT för mjukvävnad förlitar sig dock vanligtvis på användning av icke-specifika kontrastmedel för att förbättra röntgenabsorptionen och känsligheten hos mikroCT-system³⁴. Även om röntgenkontrastmedel förbättrar den totala röntgendämpningen och förbättringen av mjukvävnadsavbildning, är separation av vävnadsbeståndsdelar baserade på biokemisk sammansättning fortfarande utmanande. Det observerades emellertid att användning av lufttorkade hjärtan i kombination med ett vanligt röntgenkontrastmedel i laboratoriemiljön, PMA, selektivt färgade extracellulära komponenter. Bindväv associerad med friskt myokardium och patologisk strukturell ombyggnad vid kroniska sjukdomar förbättrades.

Processen med lufttorkning av biologisk vävnad kräver ett ingripande för att motstå deformationen av provet. Provberedning för elektronmikroskopi har liknande krav. Vanligtvis används en kritisk punkttorkningsmetod som använder en balans mellan vävnads nedsänkningsmedium, temperatur och tryck för att eliminera ytspänning av vävnadens vätskeinnehåll, vilket orsakar deformation på molekylär nivå vid avdunstning³⁵. Detta tillvägagångssätt kräver enhetlig ersättning av provets vattenhalt med flytande koldioxid, vilket är mer tillförlitligt i små och lätt diffuserbara prover. Alternativt kan vävnadens strukturella integritet förbättras och lufttorkning, dvs avdunstningsfasen kan appliceras under en längre period för att minska den totala deformationen. Molekylen HMDS genomgår silylation för att bilda en silikonbaserad ställning för att förstärka och stabilisera den molekylära organisationen av vävnadsprovet³⁶. Avdunstningen förlängs ytterligare genom att begränsa cirkulerande luftströmmar från miljön, också för att undvika inhomogen avdunstning, särskilt mellan provytan och intramurala skikt.

Många kontrastmedel har tidigare använts för mikroCT-avbildning av mjukvävnader. De vanligaste är jod, fosfotungstic syra (PTA) och PMA. Jod särskilt har använts på grund av en högre diffusionshastighet 34,37,38. Ändå fungerar jod som en katalysator för silylation av HMDS-reagens³⁶. Den katalyserade reaktionen är aggressiv och exoterm, med hög risk för destruktion av provet och säkerhetsrisk om kvarvarande HMDS kvarstår på grund av ofullständig uttorkning av provet. Både PTA och PMA upplösta i etanol kan säkert användas tillsammans med HMDS. PTA och PMA har visat sig ge större upplösningskraft av fina strukturer i icke-mineraliserade intervertebrala skivor jämfört med jodfärgning³⁸. Vid mikroCT-avbildning av däggdjursprover har PTA och PMA använts för färgning av musembryon³⁹, mus kardiovaskulärt system³⁷, kaninmuskel och hjärna⁴⁰ och svinvener⁴¹. PTA har en högre molekylmassa och densitet i lösning än PMA. Detta beror delvis på en högre atommassa av volfram (atomnummer är 74 g / mol), det huvudsakliga dämpande elementet i PTA. Som jämförelse har det tyngsta grundämnet i PMA, molybden, ett atomnummer på 42 g/mol. Både atommassa och provtäthet ligger till grund för röntgendämpning, förutom provtjockleken⁴². Genom att öka röntgenvägslängden genom att öka provstorlekarna blir röntgendämpningen känsligare för ökad provtäthet. Därför valdes PMA-kontrastmedlet med lägre densitet för att minska risken för överdämpning och för att optimera det dynamiska omfånget för bildkontrast för hjärtan av mänsklig skala. Ytterligare bevis har visat att diffusionsbelastning av PMA ger mer homogen färgning än för den större molekylen PTA i hjärtvävnad⁴³.

Metoden för leverans av kontrastmedel påverkar enhetligheten i kontrastmedelsfördelningen i hjärtvävnad (figur 3). Perfusion av kontrastmedel i det etanoldehydrerade hjärtat visade fläckiga bakgrundsfärgningsnivåer av PMA på grund av variabel vaskulär resistans. I det lufttorkade hjärtat betonas den muskellaminära strukturen av provuttorkningsprocessen, vilket ökar muskellaminär separation. Detta förbättrade i slutändan vävnadens totala permeabilitet för diffusionsbaserad kontrastmedelsbelastning. Följaktligen underlättade lufttorkning vävnad: luftkontrast vid laminära och intralaminära nivåer (Figur 4). Dessutom kan diffusionsbelastning underlättas ytterligare genom applicering under vakuum. Det har vidare visats att vävnadskrympning av icke-torkade prover är beroende av kontrastmedelskoncentration⁴⁰. Tidigare morfologisk stabilisering av provet genom lufttorkning hämmar emellertid vävnadskrympningseffekter²⁹.

Högupplösta microCT-bilder av hela organ producerar i sig stora datavolymer. Tomografiska avbildningsteknikers natur möjliggör visualisering och bildhantering bit för skiva, vilket underlättar datorbearbetningen och minnesbördan. Men för att visualisera tredimensionella bildstackar, till exempel för att återge provvolymer i tredimensionella representationer, är de rekommenderade minsta datorspecifikationerna 128 GB RAM och en processorhastighet på 3 GHz. Solid state-hårddiskar förbättrade också dataöverföringen kraftigt.

Framväxten av mikroCT-avbildning inom hjärtfältet ger många fördelar för translationella studier och klinisk validering. Fördelarna med dess tredimensionella och mikrometriska avbildning har redan visat tillämpningar för att bestämma den trombotiska bördan hos ST-höjd myokardiell ischemipatienter^44,45. Kartläggning av potentiella källor till arytmi hos patienter med strukturella hjärtsjukdomar är till stor del beroende av att bestämma fördelningen av fibrotisk ärrvävnad och lokalisera sammanvävda spår av överlevande myokardium. Andra linjens metoder för diagnos av ventrikulära arytmier använder magnetisk resonansavbildning⁴⁶. Det kan robust lokalisera tät fibros men är begränsat till morfologisk karakterisering med låg upplösning och ger begränsad inblick i mikrostrukturell ombyggnad och diffusa fördelningar av fibrotiska lesioner⁴⁷. Högupplöst undersökning av ärrfördelning och karakterisering har stor potential att förbättra vår förståelse för hjärtstrukturell ombyggnad och risken för att utveckla hjärtsvikt. Särskilt grundläggande forskningsstudier eller obduktioner kommer att dra nytta av bekräftande strukturella bilder för elektrisk kartläggning av hjärtarytmi.

Sammanfattningsvis kan hjärtan förstärkta med HMDS-behandling och lufttorkning därefter färgas med ett röntgenkontrastmedel för att förbättra röntgendämpningen av extracellulära komponenter. Specifikt, i friskt myokardium, sker PMA-ackumulering vid epitel, klaffvävnad och fack i det ventrikulära ledningssystemet som är täckt av bindväv resulterade i förbättrad röntgendämpning. Dessutom, i strukturellt sjukt myokardium, var förbättrad kontrast ytterligare selektiv för fibros.

Materials

10% neutral buffered formalin	Diapath	F0043
Calcium chloride solution	Honeywell	21114
Canulation Tubing PTFE	VWR	DENE3400102
Constant Head 1L Reservoir	Harvard Apparatus	50-0496
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767
Ethanol absolute	VWR	20821.330
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	796881
Heparin sodium (5000 U/mL)	Panpharma	3400891287301.
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma	440191-1L
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37%	Sigma	258148
Magnesium chloride solution	Honeywell	63020
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P5368
Phosphomolybdic acid hydrate	Fisher Scientific	417895000
Potassium Chloride	Sigma	P5405
Pump Tubing, 3-Stop	Ismatec	FV-96328-48
SkyScan, 1276	Bruker		micro CT
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium hydroxide solution 50% in H2O	Sigma	415413
Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	72-1407
Tubing pump	Ismatec	ISM 1089
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm	VWR	228-1279
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm	VWR	228-1283
Two-part single-use syringes 50 mL	Norm-Ject	4850001000	Pyrogen-free, PVC-free