将小鼠成纤维细胞直接重编程为黑素细胞
Summary
在这里，我们描述了一种针对黑素细胞的优化直接重编程系统和一种高效、浓缩的病毒包装系统，可确保顺利的直接重编程。
Abstract
黑素细胞功能的丧失导致白癜风，严重影响受影响个体的身心健康。目前，白癜风没有有效的长期治疗。因此，必须开发一种方便有效的白癜风治疗方法。将皮肤细胞直接重编程为黑素细胞的再生医学技术似乎是一种有前途的白癜风新疗法。这涉及将患者的皮肤细胞直接重编程为功能性黑素细胞，以帮助改善白癜风患者黑素细胞的丢失。然而，这种方法需要首先在小鼠身上进行测试。虽然直接重编程被广泛使用，但没有明确的方案可以直接重编程为黑素细胞。此外，可用转录因子的数量是压倒性的。
在这里，提出了一种浓缩的慢病毒包装系统方案，以产生用于将皮肤细胞重编程为黑素细胞的转录因子，包括Sox10，Mitf，Pax3，Sox2，Sox9和Snai2。小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）感染了所有这些转录因子的浓缩慢病毒，用于 在体外将MEF直接重编程为诱导黑素细胞（iMels）。此外，筛选了这些转录因子，并优化了系统以直接重编程为黑素细胞。iMels中黑色素特征标记物在基因或蛋白质水平上的表达显著增加。这些结果表明，将成纤维细胞直接重编程为黑素细胞可能是白癜风的成功新治疗策略，并证实了黑素细胞发育的机制，这将为成纤维细胞在 体内进一步直接重编程为黑素细胞提供基础。
Introduction
白癜风是一种皮肤病，严重影响受影响个体的身心健康。由于代谢异常，氧化应激，炎症介质的产生，细胞脱离和自身免疫反应等各种原因，功能性黑素细胞丢失，黑色素分泌停止，导致白癜风1，2的发展。这种情况发生得很广泛，在脸上尤其成问题。主要治疗方法是全身使用皮质类固醇和免疫调节剂。光疗可用于全身性或局部性疾病，并且有手术治疗，如穿孔皮肤移植和自体黑素细胞移植3，4，5。然而，使用药物治疗和光疗的患者容易复发，这些治疗的长期治疗效果较差。手术治疗是创伤性的，只有中等效果2，6。因此，白癜风需要一种新的有效治疗策略。
诱导多能干细胞（iPSCs）的重编程将这些细胞从其终末状态逆转为多能状态，这是由转录因子Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc7介导的过程。然而，由于致瘤的可能性和较长的生产时间，该技术在应用于临床环境8时遭到了怀疑。直接重编程是一种技术，它使一种类型的终端单元转换为另一种类型的终端单元9。该过程是通过合适的转录因子实现的。各种细胞已经直接成功重编程，包括心肌细胞10，神经元11和耳蜗毛细胞12。一些研究人员甚至直接 原位重新编程皮肤组织，可用于伤口修复13。直接重编程的优点包括减少等待时间和成本，降低癌症风险，减少伦理问题，以及更好地了解细胞命运决定的潜在机制9。
虽然直接重编程法被广泛使用，但目前还没有确定的方法可以将皮肤细胞直接重编程为黑素细胞，特别是因为需要考虑许多转录因子14，15。转录因子Mitf，Sox10和Pax3已被用于将皮肤细胞直接重编程为黑色素细胞14。相比之下，在另一项研究15中，MITF，PAX3，SOX2和SOX9的组合也被用于将皮肤细胞直接重编程为人类黑素细胞。在该协议中，尽管使用了不同的筛选方法，但使用Mitf，Sox10和Pax3的组合获得了相同的结果，用于将皮肤细胞直接重编程为黑色素细胞，如前所述14。开发一种从其他皮肤细胞产生黑素细胞的系统可以提供将白癜风患者的其他皮肤细胞转化为黑素细胞的方案。因此，构建一种简单有效的方法对于这种直接重编程以成功产生黑素细胞至关重要。
Protocol
Representative Results
Discussion
病毒的质量对于该方案中直接重编程为黑素细胞的成功至关重要。该方案中病毒的包装和浓缩方法简单易重复，不依赖任何其他辅助浓缩试剂。在大多数实验室中可以成功遵循该方案。为保证浓缩病毒的质量，以下几点需要特别注意。一个是HEK-293T的电池状态。虽然HEK-293T细胞是永生化细胞，但用于制造浓缩病毒的细胞必须是10次传代内的健康细胞（滴度随着传代次数的增加而降低）。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究部分由国家自然科学基金（82070638和81770621）和江苏省自然科学基金（BK20180281）资助。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
Referências
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