मेलानोसाइट्स में माउस फाइब्रोब्लास्ट्स का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग
Summary
यहां, हम मेलानोसाइट्स के लिए एक अनुकूलित प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग सिस्टम और एक उच्च दक्षता, केंद्रित वायरस पैकेजिंग सिस्टम का वर्णन करते हैं जो चिकनी प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग सुनिश्चित करता है।
Abstract
मेलानोसाइट्स के कार्य का नुकसान विटिलिगो की ओर जाता है, जो प्रभावित व्यक्तियों के शारीरिक और मानसिक स्वास्थ्य को गंभीररूप से प्रभावित करता है। वर्तमान में, विटिलिगो के लिए कोई प्रभावी दीर्घकालिक उपचार नहीं है। इसलिए, विटिलिगो के लिए एक सुविधाजनक और प्रभावी उपचार विकसित करना आवश्यक है। मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए पुनर्योजी चिकित्सा प्रौद्योगिकी विटिलिगो का एक आशाजनक उपन्यास उपचार प्रतीत होता है। इसमें विटिलिगो के रोगियों में मेलानोसाइट्स के नुकसान को कम करने में मदद करने के लिए कार्यात्मक मेलानोसाइट्स में रोगी की त्वचा कोशिकाओं का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग शामिल है। हालांकि, इस विधि को पहले चूहों पर परीक्षण करने की आवश्यकता है। यद्यपि प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, मेलानोसाइट्स में प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए कोई स्पष्ट प्रोटोकॉल नहीं है। इसके अलावा, उपलब्ध प्रतिलेखन कारकों की संख्या भारी है।
यहां, एक केंद्रित लेंटीवायरस पैकेजिंग सिस्टम प्रोटोकॉल को सोलेनोसाइट्स के लिए त्वचा कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करने के लिए चुने गए प्रतिलेखन कारकों का उत्पादन करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें सोक्स 10, मिटीएफ, पैक्स 3, सोक्स 2, सोक्स 9 और एसएनएआई 2 शामिल हैं। माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) इन विट्रो में प्रेरित मेलानोसाइट्स (आईमेल्स) में एमईएफ के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए इन सभी प्रतिलेखन कारकों के लिए केंद्रित लेंटिवायरस से संक्रमित थे। इसके अलावा, इन प्रतिलेखन कारकों की जांच की गई थी, और सिस्टम को मेलानोसाइट्स के लिए प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए अनुकूलित किया गया था। जीन या प्रोटीन स्तर पर आईमेल्स में मेलेनिन के विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई थी। इन परिणामों से पता चलता है कि मेलानोसाइट्स के लिए फाइब्रोब्लास्ट्स का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग विटिलिगो के लिए एक सफल नई चिकित्सीय रणनीति हो सकती है और मेलानोसाइट विकास के तंत्र की पुष्टि कर सकती है, जो विवो में मेलानोसाइट्स में फाइब्रोब्लास्ट्स के आगे प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए आधार प्रदान करेगी।
Introduction
विटिलिगो एक त्वचा रोग है जो प्रभावित व्यक्तियों के शारीरिक और मानसिक स्वास्थ्य को गंभीर रूप से प्रभावित करता है। चयापचय संबंधी असामान्यताओं, ऑक्सीडेटिव तनाव, भड़काऊ मध्यस्थों की पीढ़ी, सेल टुकड़ी और ऑटोइम्यून प्रतिक्रिया सहित विभिन्न कारणों से, कार्यात्मक मेलानोसाइट्स खो जाते हैं, और मेलेनिन का स्राव बंद हो जाता है, जिससे विटिलिगो 1,2 का विकास होता है। यह स्थिति व्यापक रूप से होती है और चेहरे पर विशेष रूप से समस्याग्रस्त होती है। मुख्य उपचार कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स और इम्यूनोमोड्यूलेटर का प्रणालीगत उपयोग है। फोटोथेरेपी का उपयोग प्रणालीगत या स्थानीय बीमारियों के लिए किया जा सकता है, और सर्जिकल उपचार हैं, जैसे छिद्रित त्वचा प्रत्यारोपण और ऑटोलॉगस मेलानोसाइट प्रत्यारोपण 3,4,5। हालांकि, ड्रग थेरेपी और फोटोथेरेपी का उपयोग करने वाले रोगियों को पुनरुत्थान का खतरा होता है, और इन उपचारों में खराब दीर्घकालिक चिकित्सीय प्रभाव होते हैं। सर्जिकल उपचार दर्दनाक है और केवल मामूली प्रभावी 2,6 है। इसलिए, विटिलिगो के लिए एक नई और प्रभावी चिकित्सीय रणनीति की आवश्यकता है।
प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का रीप्रोग्रामिंग इन कोशिकाओं को उनके टर्मिनल राज्य से प्लुरिपोटेंट अवस्था में उलट देता है, प्रतिलेखन कारकों, अक्टूबर 4, सोक्स 2, केएलएफ 4 और सी-माइक7 द्वारा मध्यस्थता की जाने वाली प्रक्रिया। हालांकि, ट्यूमरजेनेसिटी की संभावना और लंबे उत्पादन समय के कारण, नैदानिक सेटिंग्स8 पर लागू होने पर इस तकनीक को संदेह के साथ मुलाकात की गई है। डायरेक्ट रीप्रोग्रामिंग एक ऐसी तकनीक है जो एक प्रकार के टर्मिनल सेल को दूसरे प्रकार के टर्मिनल सेल9 में बदल देती है। यह प्रक्रिया उपयुक्त प्रतिलेखन कारकों द्वारा प्राप्त की जाती है। विभिन्न कोशिकाओं को पहले से ही सफलतापूर्वक पुन: प्रोग्राम किया गया है, जिसमें कार्डियोमायोसाइट्स10, न्यूरॉन्स11 और कॉक्लियर हेयर सेल12 शामिल हैं। कुछ शोधकर्ताओं ने त्वचा के ऊतकों को सीधे सीटू में पुन: प्रोग्राम किया है, जिसका उपयोग घाव की मरम्मत के लिए किया जा सकताहै 13. प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के फायदों में कम प्रतीक्षा समय और लागत, कैंसर का कम जोखिम, कम नैतिक समस्याएं और सेल भाग्य निर्धारण अंतर्निहित तंत्र की बेहतर समझ शामिलहै 9.
यद्यपि प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, वर्तमान में मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए कोई निश्चित विधि नहीं है, खासकर कई प्रतिलेखन कारकों के कारण14,15 माना जाता है। प्रतिलेखन कारक, मिटीएफ, सोक्स 10 और पैक्स 3, का उपयोग मेलानोसाइट्स14 में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए किया गया है। इसके विपरीत, एमआईटीएफ, पैक्स 3, एसओएक्स 2 और एसओएक्स 9 के संयोजन का उपयोग एक अन्य अध्ययन15 में मानव मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए भी किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, एक अलग स्क्रीनिंग विधि के उपयोग के बावजूद, एक ही परिणाम मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष पुन: प्रोग्रामिंग के लिए mitf, Sox10, और पैक्स 3 के संयोजन के साथ प्राप्त किया गया था जैसा कि पहले14 वर्णित है। अन्य त्वचा कोशिकाओं से मेलानोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक प्रणाली विकसित करना विटिलिगो रोगियों की अन्य त्वचा कोशिकाओं को मेलानोसाइट्स में बदलने के लिए एक योजना प्रदान कर सकता है। इसलिए, मेलेनोसाइट्स को सफलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए इस प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग के लिए एक सरल और कुशल विधि का निर्माण करना महत्वपूर्ण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में मेलानोसाइट्स को प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग की सफलता के लिए वायरस की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में पैकेजिंग और ध्यान केंद्रित करने वाले वायरस की विधि सरल और दोहराने में आस?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को आंशिक रूप से चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82070638 और 81770621) और जियांग्सू प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (बीके 20180281) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
Referências
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