Direkt omprogrammering av musfibroblaster till melanocyter
Summary
Här beskriver vi ett optimerat direkt omprogrammeringssystem för melanocyter och ett högeffektivt, koncentrerat virusförpackningssystem som säkerställer smidig direkt omprogrammering.
Abstract
Förlusten av melanocyternas funktion leder till vitiligo, vilket allvarligt påverkar de drabbade individernas fysiska och psykiska hälsa. För närvarande, Det finns ingen effektiv långsiktig behandling för vitiligo. Därför är det absolut nödvändigt att utveckla en bekväm och effektiv behandling för vitiligo. Regenerativ medicin teknik för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter verkar vara en lovande ny behandling av vitiligo. Detta innebär direkt omprogrammering av patientens hudceller till funktionella melanocyter för att förbättra förlusten av melanocyter hos patienter med vitiligo. Denna metod måste dock först testas på möss. Även om direkt omprogrammering används i stor utsträckning finns det inget tydligt protokoll för direkt omprogrammering till melanocyter. Dessutom är antalet tillgängliga transkriptionsfaktorer överväldigande.
Här presenteras ett koncentrerat lentivirusförpackningssystemprotokoll för att producera transkriptionsfaktorer valda för omprogrammering av hudceller till melanocyter, inklusive Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 och Snai2. Musembryonala fibroblaster (MEF) infekterades med det koncentrerade lentiviruset för alla dessa transkriptionsfaktorer för direkt omprogrammering av MEF till inducerade melanocyter (iMels) in vitro. Dessutom screenades dessa transkriptionsfaktorer och systemet optimerades för direkt omprogrammering till melanocyter. Uttrycket av de karakteristiska markörerna för melanin i iMels vid gen- eller proteinnivån ökade signifikant. Dessa resultat tyder på att direkt omprogrammering av fibroblaster till melanocyter kan vara en framgångsrik ny terapeutisk strategi för vitiligo och bekräfta mekanismen för melanocytutveckling, vilket kommer att ligga till grund för ytterligare direkt omprogrammering av fibroblaster till melanocyter in vivo.
Introduction
Vitiligo är en hudsjukdom som allvarligt påverkar den fysiska och psykiska hälsan hos de drabbade individerna. Av olika skäl, inklusive metaboliska abnormiteter, oxidativ stress, generering av inflammatoriska mediatorer, cellavlossning och autoimmunt svar, förloras de funktionella melanocyterna och utsöndringen av melanin stoppas, vilket leder till utveckling av vitiligo 1,2. Detta tillstånd förekommer i stor utsträckning och är särskilt problematiskt i ansiktet. Huvudbehandlingen är den systemiska användningen av kortikosteroider och immunmodulatorer. Fototerapi kan användas för systemiska eller lokala sjukdomar, och det finns kirurgiska behandlingar, såsom perforerad hudtransplantation och autolog melanocyttransplantation 3,4,5. Patienter som använder läkemedelsbehandling och fototerapi är dock benägna att återfalla, och dessa behandlingar har dåliga långsiktiga terapeutiska effekter. Kirurgisk behandling är traumatisk och endast måttligt effektiv 2,6. Därför behövs en ny och effektiv terapeutisk strategi för vitiligo.
Omprogrammeringen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) vänder dessa celler från deras terminala tillstånd till ett pluripotent tillstånd, en process som förmedlas av transkriptionsfaktorerna, Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc7. På grund av risken för tumorigenicitet och den långa produktionstiden har denna teknik dock mötts med skepsis när den tillämpas på kliniska inställningar8. Direkt omprogrammering är en teknik som gör att en typ av en terminalcell omvandlas till en annan typ av en terminalcell9. Denna process uppnås genom lämpliga transkriptionsfaktorer. Olika celler har redan omprogrammerats direkt framgångsrikt, inklusive kardiomyocyter10, neuroner11 och cochleära hårceller12. Vissa forskare har till och med omprogrammerat hudvävnad direkt in situ, som kan användas för sårreparation13. Fördelarna med direkt omprogrammering inkluderar minskade väntetider och kostnader, lägre risk för cancer, färre etiska problem och en bättre förståelse för mekanismen bakom bestämning av cellöden9.
Även om den direkta omprogrammeringsmetoden används i stor utsträckning finns det för närvarande ingen bestämd metod för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter, särskilt på grund av de många transkriptionsfaktorer som ska betraktas som14,15. Transkriptionsfaktorerna, Mitf, Sox10 och Pax3, har använts för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter14. Däremot har kombinationen av MITF, PAX3, SOX2 och SOX9 också använts för direkt omprogrammering av hudceller till humana melanocyter i en annan studie15. I detta protokoll, trots användningen av en annan screeningmetod, erhölls samma resultat med kombinationen av Mitf, Sox10 och Pax3 för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter som beskrivits tidigare14. Att utveckla ett system för att generera melanocyter från andra hudceller kan ge ett system för att omvandla andra hudceller av vitiligopatienter till melanocyter. Därför är det viktigt att konstruera en enkel och effektiv metod för denna direkta omprogrammering för att generera melanocyter framgångsrikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virusets kvalitet är avgörande för framgången med direkt omprogrammering till melanocyter i detta protokoll. Metoden för förpackning och koncentration av virus i detta protokoll är enkel och lätt att upprepa och är inte beroende av något annat extra koncentrerat reagens. Detta protokoll kan följas framgångsrikt i de flesta laboratorier. För att säkerställa kvaliteten på det koncentrerade viruset behöver följande punkter särskild uppmärksamhet. En är cellstatusen för HEK-293T. Även om HEK-293T-celle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes delvis av bidrag från National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) och Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
Referências
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. Vitiligo. Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).
- Picardo, M., et al. Vitiligo. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. Surgical therapies for vitiligo. Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
