Desenvolvimento de um modelo de co-cultura celular para imitar isquemia cardíaca/reperfusão in vitro

Summary

A distância espacial é um parâmetro fundamental na avaliação da lesão por hipóxia/reoxigenação em um modelo de cocultura de camadas separadas de células células endoteliais e cardiomiócitos, sugerindo, pela primeira vez, que a otimização do ambiente espacial de co-cultura é necessária para fornecer um modelo in vitro favorável para testar o papel das células endoteliais na proteção de cardiomiócitos.

Abstract

A doença isquêmica do coração é a principal causa de morte e incapacidade em todo o mundo. A reperfusão causa lesões adicionais além da isquemia. As células endoteliais (CES) podem proteger os cardiomiócitos (CMs) da lesão de reperfusão através de interações célula-células. Co-culturas podem ajudar a investigar o papel das interações célula-células. Uma cocultura mista é a abordagem mais simples, mas é limitada, pois tratamentos isolados e análises a jusante de tipos de células únicas não são viáveis. Para investigar se as CES podem atenuar os danos celulares cm dependentes de dose e se essa proteção pode ser ainda mais otimizada variando a distância de contato entre as duas linhas celulares, usamos células endotelias da artéria coronária primária do rato e cardiomiócitos de rato adulto para testar três tipos de inserções de cultura celular que variaram em sua distância de camada intercelular a 0,5, 1.0, e 2,0 mm, respectivamente. Somente em CMs, a lesão celular avaliada pela liberação de lactato desidrogenase (LDH) aumentou significativamente durante a hipóxia e ainda mais após a reoxigenação quando a distância foi de 2,0 mm em comparação com 0,5 e 1,0 mm. Quando as CES e os CMs estavam em contato quase direto (0,5 mm), houve apenas uma atenuação leve da lesão de reoxigenação de CMs após a hipóxia. Essa atenuação aumentou significativamente quando a distância espacial foi de 1,0 mm. Com 2,0 mm de distância, eCs atenuaram lesão cm durante hipoxia e hipóxia/reoxigenação, indicando que é necessário distanciamento cultural suficiente para os CES conversam com CMs, de modo que moléculas de sinal secretado possam circular e estimular totalmente caminhos de proteção. Nossos achados sugerem, pela primeira vez, que a otimização do ambiente espacial de co-cultura EC/CM é necessária para fornecer um modelo in vitro favorável para testar o papel das CE na proteção de CM contra lesões simuladas de isquemia/reperfusão. O objetivo deste relatório é fornecer uma abordagem passo a passo para que os investigadores usem este importante modelo a seu favor.

Introduction

A doença isquêmica do coração é a principal causa de morte e incapacidade em todo o mundo ^1,2. No entanto, o processo de tratamento da reperfusão pode causar a morte por cardiomiócito, conhecido como isquemia miocárdica/reperfusão (IR), para o qual ainda não há remédio efetivo³. Células endoteliais (CE) têm sido sugeridas para proteger cardiomiócitos (CMs) através da secreção de sinais paracrírinos, bem como interações célula-célula⁴.

Modelos de cocultura celular têm sido usados extensivamente para investigar o papel das interações cél....

Protocol

1. Preparação/revestimento experimental

1. Mantenha CMs e CEs de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Descongele as duas linhas de celular quando chegarem dos vendedores. Placa em frascos T25 depois de ser lavada com mídia fresca. Recomenda-se a compra de cada mídia de cultura celular dos mesmos fornecedores de onde as células foram compradas. No dia seguinte, refresque as células com mídia e use quando confluente.
   2. Mantenha a incubadora de cultura celular a 37 °C com 21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂ e mantenha umidificada.
      NOTA: As células endotelias da artéria coronária primária do rato utilizada....

Results

Todos os três tipos de pastilhas (A, B, C) utilizadas neste experimento têm o mesmo tamanho de poros de 0,4 μm. A única diferença entre eles é a altura insert-to-base, que permite que as distâncias entre as duas camadas de células co-cultivadas sejam 0,5, 1,0 e 2,0 mm, respectivamente, (Figura 3) e que são de diferentes fornecedores (para detalhes ver Tabela de Materiais).

Para estabelecer um modelo de co-cultura in vitro com camadas sepa.......

Discussion

Passos críticos no protocolo
Modelos de cocultura celular têm sido usados para estudar mecanismos celulares de cardioproteção. Como criar duas camadas separadas com uma distância significativa entre elas é, portanto, crucial para o desenvolvimento de um modelo de cocultura adequado. Um desafio no estudo de IR simulado, ou seja, RH, lesão é que não só a isquemia (hipoxia) em si, mas também a reperfusão (reoxigenação) agrava a disfunção celular. Portanto, um modelo realista precisa refletir essas caract.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardiomiócitos de camundongos adultos (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolado de tecido cardíaco de camundongo adulto C57BL/6J
Contador de células automatizado Countess II	Invitrogen	A27977	Contagem de células para calcular o número
de células Gabinete de Biossegurança Nuaire		NU425400	Capuz estéril de cultura de células
Meio de congelamento	Cell Biologics Inc	6916	Usado para congelamento de células para armazenamento de linha celular de longo prazo
Incubadora de Cultura de Células	Nuaire	Nu-5500	Para fornecer condição de vida celular normal (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37° C, umidificado)
Tanque de Gás da Incubadora de Cultura de Células	A-L Gases Comprimidos	UN1013	Gás necessário para incubadora de cultura de células
Inserções de cultura de células A (0,5 mm)	Corning Inc	353095	Usado para co-cultura EC-CM
Inserções de cultura de células B (1,0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Usado para co-cultura EC-CM
Inserções de cultura de células C (2,0 mm)	Greiner Bio-One	662640	de co-cultura EC-CM
	Anstel Enterprises Inc	4235	Para chapeamento e passagem de cultura de células
Frascos de Cultura de Células CMs T25	Celprogen Inc	E11041-14	Usado para cultura regular de CMs, revestido pelo fabricante
CMs Meio de Cultura de Células Completo	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs meio de cultura completo
CMs Meio de Cultura de Células Completo sem fenol	Celprogen Inc	M11041-14PN	Meio de cultura de CMs sem vermelho de fenol usado durante a medição de
LDH Placas de Cultura de Células CMs 96 poço	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Usado para experimentos de medição de LDH, revestido pelo fabricante
CMs Meio de cultura de células de hipóxia	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cultura de células sob condição hipóxica (livre de glicose e soro)
Lâminas de câmara de contagem de células Countess	Invitrogen	C10283	Lâminas de contagem usadas para contador de células
Kit de citotoxicidade	Cyquant LDHThermo Scientific	C20301	Kit de medição LDH
ECs Frascos de Cultura de Células T25	Fisher Scientific	FB012935	Usado para ECs cultura regular
ECs Meio de cultura celular Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs meio completo de cultura
ECs Meio de cultura celular completo Livre de fenol	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs meio de cultura sem vermelho de fenol usado durante a medição de LDH
ECs Placas de cultura celular 96 poços	Fisher Scientific (Costar)	3370	Usado para experimentos de LDH Cell
	Biologics	Inc 6950	Usado para revestir frascos e placas para ECs
Hypoxia Cell Culture Medium Cell	Biologics Inc	GPF1168	ECs cultura de células sob condição hipóxica (sem glicose e soro)
Soro Fetal Bovino (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI aprovado pelo USDA para cultura e manutenção de células
Câmara de hipóxia	StemCell Technologies	27310	Para criar uma condição hipóxica com ambiente de 0,01% O2< / sub>
Medidor de vazão de câmara de hipóxia	StemCell Technologies	27311	Para conectar com o tanque de gás hipóxico para uma velocidade de fluxo de gás consistente
Tanque de gás hipóxico (0,01% O2< / sub> cilindro)	Gases comprimidos AL	, UN1956	Usado para lavar meios e câmaras hipóxicas (0,01%O2/5%CO2/94,99N2)
Microscópio	Nikon	TMS	Para observar a condição celular
Células endoteliais primárias da artéria coronária de camundongo (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolado da artéria coronária de camundongos C57BL/6
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	Para processo de cultura de células, experimentos, preparação de soluções, etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	Para processo de cultura celular, experimentos, preparação de solução etc.
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Usado para lavagem de células durante cultura ou experimentos Leitor de
placas	BioTek Instrumento	11120533	Leitura de placas colorimétricas ou fluorométricas
Reação 96 Well Palte (transparente sem tampa)	Fisher Scientific	12565226	Usado para leitura de placas de medição LDH
Tripsina / EDTA para CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x filtrado estéril e testado para cultura de tecidos
Tripsina / EDTA para ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0,25%, teste de cultura celular