पूर्व विवो रेटिना ऊतक नमूनों में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस का निर्धारण
Summary
यहाँ वर्णित एक वाणिज्यिक bioanalyzer का उपयोग कर पूर्व विवो रेटिना ऊतक के नमूनों में माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख और ग्लाइकोलाइटिक दर परख प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है.
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन सभी कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण ऊर्जा पैदा करने वाला मार्ग है, विशेष रूप से रेटिना फोटोरिसेप्टर जो अत्यधिक सक्रिय चयापचय के अधिकारी हैं। इसके अलावा, फोटोरिसेप्टर भी कैंसर कोशिकाओं की तरह उच्च एरोबिक ग्लाइकोलाइसिस का प्रदर्शन करते हैं। इन चयापचय गतिविधियों के सटीक माप शारीरिक परिस्थितियों में और रोग राज्यों में सेलुलर होमियोस्टैसिस में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। उच्च थ्रूपुट माइक्रोप्लेट-आधारित assays माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और जीवित कोशिकाओं में विभिन्न चयापचय गतिविधियों को मापने के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, इनमें से अधिकांश सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए विकसित किए गए हैं और बरकरार ऊतक नमूनों के लिए और पूर्व विवो के आवेदन के लिए अनुकूलित नहीं किए गए हैं। यहां वर्णित एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल है, माइक्रोप्लेट-आधारित प्रतिदीप्ति तकनीक का उपयोग करके, सीधे माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के संकेतक के रूप में ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) को मापने के लिए, साथ ही साथ ग्लाइकोलाइसिस के संकेतक के रूप में बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) बरकरार पूर्व विवो रेटिना ऊतक में। इस विधि का उपयोग वयस्क माउस रेटिना में चयापचय गतिविधियों का सफलतापूर्वक आकलन करने और उम्र बढ़ने और बीमारी के सेलुलर तंत्र की जांच में इसके आवेदन को प्रदर्शित करने के लिए किया गया है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया आवश्यक ऑर्गेनेल हैं जो सेलुलर चयापचय, सिग्नलिंग, होमियोस्टैसिस और एपोप्टोसिस को कई महत्वपूर्ण शारीरिक प्रक्रियाओं का समन्वय करके नियंत्रित करते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (OXPHOS) के माध्यम से एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पन्न करने के लिए सेल में पावरहाउस के रूप में कार्य करता है और ऊर्जा प्रदान करता है जो लगभग सभी सेलुलर घटनाओं का समर्थन करता है। सेलुलर ऑक्सीजन का अधिकांश हिस्सा माइटोकॉन्ड्रिया में चयापचय किया जाता है, जहां यह एरोबिक श्वसन के दौरान इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) में अंतिम इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में कार्य करता है। एटीपी की कम मात्रा को साइटोसोल में ग्लाइकोलाइसिस से भी उत्पादित किया जा सकता है, जहां ग्लूकोज को पाइरूवेट में परिवर्तित किया जाता है, जिसे आगे लैक्टेट में परिवर्तित किया जा सकता है या माइटोकॉन्ड्रिया में ले जाया जा सकता है और एसिटाइल-सीओए में ऑक्सीकरण किया जा सकता है, जो ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड चक्र (टीसीए चक्र) में एक सब्सट्रेट है।
रेटिना स्तनधारियों में सबसे अधिक चयापचय रूप से सक्रिय ऊतकों में से एक है2, जो माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के उच्च स्तर और अत्यधिक उच्च ऑक्सीजन खपत को प्रदर्शित करता है3। रॉड और शंकु फोटोरिसेप्टर में माइटोकॉन्ड्रिया 4 का उच्च घनत्व होता है, और OXPHOS रेटिना 5 में अधिकांश एटीपी उत्पन्न करता है। इसके अलावा, रेटिना भी एरोबिक ग्लाइकोलाइसिस 6,7 पर ग्लूकोज को लैक्टेट 5 में परिवर्तित करके बहुत अधिक निर्भर करता है। माइटोकॉन्ड्रियल दोष विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों से जुड़े होते हैं8,9; और अपनी अद्वितीय उच्च ऊर्जा मांगों के साथ, रेटिना विशेष रूप से चयापचय दोषों के लिए कमजोर है, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल OXPHOS4 और ग्लाइकोलाइसिस 10 को प्रभावित करने वाले लोग शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और ग्लाइकोलाइसिस में दोष रेटिना 11,12 और धब्बेदार 13 अपक्षयी रोगों, उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन 10,14,15,16, और मधुमेह रेटिनोपैथी 17,18 में फंसे हुए हैं। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस के सटीक माप रेटिना की अखंडता और स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रदान कर सकते हैं।
माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के निर्धारण के माध्यम से मापा जा सकता है। यह देखते हुए कि ग्लूकोज का पाइरूवेट में रूपांतरण और बाद में लैक्टेट के परिणामस्वरूप प्रोटॉन के एक्सट्रूज़न और बाह्य कोशिकीय वातावरण के अम्लीकरण में परिणाम होता है, बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) के माप ग्लाइकोलाइसिस फ्लक्स का संकेत प्रदान करते हैं। चूंकि रेटिना अंतरंग संबंधों और सक्रिय तालमेल के साथ कई सेल प्रकारों से बना है, जिसमें सब्सट्रेट्स 6 का आदान-प्रदान शामिल है, इसलिए बरकरार लैमिनेशन और सर्किटरी के साथ पूरे रेटिना ऊतक के संदर्भ में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और चयापचय का विश्लेषण करना अनिवार्य है। पिछले कई दशकों से, क्लार्क प्रकार के O2 इलेक्ट्रोड और अन्य ऑक्सीजन माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग रेटिना 19,20,21 में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए किया गया है। इन ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड की संवेदनशीलता में प्रमुख सीमाएं होती हैं, एक बड़ी नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है, और निलंबित नमूने की निरंतर सरगर्मी की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर सेलुलर और ऊतक संदर्भ के विघटन की ओर जाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को एक माइक्रोप्लेट-आधारित, प्रतिदीप्ति तकनीक का उपयोग करके विकसित किया गया था ताकि ताजा विच्छेदित पूर्व विवो माउस रेटिना ऊतक में माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय को मापा जा सके। यह ओसीआर और ईसीएआर दोनों के मध्य-थ्रूपुट वास्तविक समय माप की अनुमति देता है, साथ ही पूर्व विवो रेटिना ऊतक के एक छोटे से नमूने (1 मिमी पंच) का उपयोग करके निलंबन और निरंतर सरगर्मी की आवश्यकता से बचता है।
यहाँ प्रदर्शित माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परख और ताजा विच्छेदित रेटिना पंच डिस्क पर ग्लाइकोलाइटिक दर परख के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया है. यह प्रोटोकॉल एक पूर्व विवो ऊतक संदर्भ में माइटोकॉन्ड्रिया से संबंधित चयापचय गतिविधियों के माप की अनुमति देता है। सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करके किए गए assays से अलग, यहां प्राप्त रीडिंग ऊतक स्तर पर संयुक्त ऊर्जा चयापचय को प्रतिबिंबित करते हैं और ऊतक के भीतर विभिन्न सेल प्रकारों के बीच बातचीत से प्रभावित होते हैं। प्रोटोकॉल को पहले से प्रकाशित संस्करण 22,23 से संशोधित किया गया है ताकि आइलेट कैप्चर प्लेट के साथ Agilent Seahorse extracellular flux 24-wells (XFe24) विश्लेषक की नई पीढ़ी के अनुकूल हो सके। परख माध्यम, इंजेक्शन यौगिक सांद्रता, और परख चक्र की संख्या / अवधि भी रेटिना ऊतक के लिए अनुकूलित किया गया है। रेटिना पंच डिस्क की तैयारी के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल दिया गया है। प्रोग्राम सेटअप और डेटा विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी निर्माता के उपयोगकर्ता गाइड 24,25,26 से प्राप्त की जा सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रदान की गई है कि यहां पूर्व विवो, ताजा विच्छेदित रेटिना पंच डिस्क का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस गतिविधि के माइक्रोप्लेट-आधारित assays प्रदर्शन करने के लिए विस्तृत निर्देश द?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (ZIAEY000450 और ZIAEY0000546) के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित है।
Materials
| 1X PBS | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| 2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution | Sigma | D6134 | Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time |
| 30-gauge needle | BD Precision Glide | 305106 | |
| Antimycin A, 10 mM stock solution | Sigma | A8674 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Bam15, 10 mM stock solution | TimTec | ST056388 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Biopsy puncher, 1 mm | Integra Miltex | 33-31AA | |
| Cell-Tak | Corning Life Sciences | CB40240 | |
| CO2 asphyxiation chamber | |||
| Dissection forceps-Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | Stright tip |
| Dissection forceps-Dumont #7 | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved tip |
| Dissection microscope | |||
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Curved, Serrated tip |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15004-08 | Curved tip |
| NaOH solution, 1 M | Sigma-Aldrich | S8263 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Rotenone, 10 mM stock solution | Sigma | R8875 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Seahorse calibration medium | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose | Agilent | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pyruvate | Agilent | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine | Agilent | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | pH 7.4, with 5 mM HEPES |
| Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak | Agilent | 103518-100 | Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate |
| Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer | Agilent | ||
| Sodium bicarbonate solution, 0.1 M | Sigma-Aldrich | S5761 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Superfine eyelash brush | Ted Pella | 113 |
Referências
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