Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.
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Artigo de método
Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mitocondrial Ca2+ desempenha um papel crítico no controle do tampão citosolico Ca2+, metabolismo energético e transdução de sinal celular. A sobrecarga do Ca2+ mitocondrial contribui para várias condições patológicas, incluindo neurodegeneração e morte celular apoptótica em doenças neurológicas. Aqui apresentamos um tipo celular específico e mitocôndrias visando abordagem molecular para imagem mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo. Construímos plasmídeos de DNA codificando mitocôndrias com alvo genético de indicadores Ca2+ codificados geneticamente (GECIs) GCaMP5G ou GCaMP6s (GCaMP5G/6s) com promotores específicos de astrócitos e neurônios gfaABC1D e CaMKII e sequência de alvo de mitocôndrias (mito-). Para imagens mitocondriais in vitro Ca2+, os plasmídeos foram transfectados em astrócitos e neurônios cultivados para expressar GCaMP5G/6s. Para imagens in vivo mitocondrial Ca2+, vetores virais associados a Adeno (AAVs) foram preparados e injetados nos cérebros do camundongo para expressar GCaMP5G/6s em mitocôndrias em astrócitos e neurônios. Nossa abordagem fornece um meio útil para a imagem mitocondrial Ca2+ dinâmica em astrócitos e neurônios para estudar a relação entre a sinalização citosolic e mitocondrial Ca2+, bem como interações astrócito-neurônio.
Introdução
Mitocôndrias são organelas subcelulares dinâmicas e são consideradas como potências celulares para produção de energia. Por outro lado, as mitocôndrias podem levar o Ca2+ à matriz em resposta aos aumentos locais ou citosóicos ca2+. A absorção mitocondrial Ca2+ afeta a função mitocondrial, incluindo processos metabólicos como reações no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e fosforilação oxidativa, e regula as proteínas sensíveis ca2+em condições fisiológicas1,2,3,4. A sobrecarga mitocondrial Ca....
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Protocolo
Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Missouri-Columbia.
1. Construção de plasmídeos de DNA
NOTA: Para imagens in vitro e in vivo, plasmídeos de DNA codificam GCaMP5G/6s com promotores específicos de astrócitos e neurônios e sequências de alvo mitocondrial.
- Inserir matriz mitocondrial (MM)-targeting sequence (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 no clon sites de regência EcoRI e BamH....
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Resultados
O objetivo deste estudo foi fornecer uma metodologia para a imagem mitocondrial Ca2+ sinais utilizando GECIs em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo. Os resultados das imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ são apresentados aqui.
Sinalização mitocondrialin vitro Ca2+ em astrócitos e neurônios cultivados
A absorção mitocondrial Ca.......
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Discussão
Neste artigo, fornecemos um método e protocolo para imagens mitocondrial Ca2+ sinais em astrócitos e neurônios. Implementamos estratégias específicas de segmentação de mitocôndrias e tipo celular para expressar GECI GCaMP5G/6s. Para atingir GCaMP5G/6s em mitocôndrias, incluímos uma sequência de metas de mitocôndrias nos plasmídeos. Para expressar GCaMP5G/6s em astrócitos e neurônios in vivo,inserimos um promotor específico de astrócito gfaABC1D e promotor específico de neurônios CaMKII nos plasmídeos........
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde de Distúrbios Neurológicos e AVC (NINDS) concede R01NS069726 e R01NS094539 à SD. Agradecemos a Erica DeMers pela gravação de áudio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pomada de lágrimas artificiais | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% petrolato branco |
| Cola de cianoacrilato | Instrumentos de Precisão | 3M Vetbond Adesivo | |
| Dissecando estereomicroscópio | Nikon | SMZ 2B | Cirurgia |
| Dumont fórceps com ponta fina | Ferramentas de Belas Ciências | 11255-20 | para remoção de |
| lamínulas de vidro dura, 0,13-0,17 mm de espessura | Fisher Scientific | 12-542A | para cobertura da janela craniana |
| Micro broca de alta velocidade | Ferramentas de ciências finas | 18000-17 | com broca de polimento ósseo |
| Seringa de injeção | Hamilton | 2,5 ml | para injeção viral |
| Cetamina | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg de peso corporal |
| Baixo ponto de fusão agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reduzindo artefatos de movimento |
| Armação de metal | Feito sob medida | ver Fig 1 | para fixação do cérebro ao estágio do microscópio |
| Controlador de bomba de microseringa | World Precision Instruments | UMP3 | Controlador de velocidade de injeção |
| Dispositivo estereotáxico de mouse | Stoelting | 51725 | para segurar ratos |
| Câmara de perfusão | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Sistema de perfusão | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Almofada de aquecimento auto-regulável | Fine Science Tools | 21061 | para prevenir a hipotermia de camundongos |
| Sulforrodamina 101 | Invitrogen | S-359 | corante fluorescente vermelho para rotular astrócitos |
| Tesoura cirúrgica, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | para dissecção |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | para limpeza de material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg / kg de peso corporal |
Referências
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T.
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Reimpressões e permissões
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