パーキンソン病の6-ヒドロキシドーパミンラットモデル
Summary
6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)モデルは、パーキンソン病の理解を進めるために何十年も使用されてきました。このプロトコルでは、内側前脳束に6-OHDAを注射することによってラットの片側黒質線条体病変を行う方法、運動欠損を評価する方法、およびステッピング試験を用いて病変を予測する方法を実証する。
Abstract
パーキンソン病(PD)の運動症状 – 徐脈、無動症、および安静時の振戦 – は、黒質パースコンパクト(SNc)およびドーパミン作動性線条体欠損におけるドーパミン作動性ニューロンの神経変性の結果である。動物モデルは、実験室でヒトの病理をシミュレートするために広く使用されている。げっ歯類は、取り扱いとメンテナンスの容易さのためにPDに最も使用される動物モデルです。さらに、PDの解剖学的および分子的、細胞的、および薬理学的メカニズムは、げっ歯類およびヒトにおいて類似している。神経毒である6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)をラットの内側前脳束(MFB)に注入すると、ドーパミン作動性ニューロンの重度の破壊が再現され、PD症状がシミュレートされる。このプロトコルは、PDのラットモデルにおいてMFBにおける6-OHDAの片側マイクロインジェクションを行う方法を示し、6-OHDAによって誘発される運動欠損を示し、ステッピング試験を通じてドーパミン作動性病変を予測した。6-OHDAは、対側前肢で実行されるステップ数に著しい障害を引き起こす。
Introduction
PDの主な神経病理学的特徴は、黒質パースコンパクタ(SNc)におけるドーパミン作動性ニューロンの慢性進行性神経変性およびα-シヌクレインタンパク質1を含むレビー小体の存在である。SNcドーパミン作動性ニューロンが黒質線条体経路を介して軸索を線条体に投影すると、SNcにおけるニューロンの神経変性は線条体にドーパミン作動性欠損をもたらす2。線条体にドーパミンがないと、PDの主な運動症状の原因となる直接的および間接的な運動制御経路の活動に不均衡が生じる:無動症(遅い動き)、徐脈(動きを開始することの困難さ)、筋肉のこわばり、および安静時の振戦3,4,5。
PDの発症に関与する分子的および生理学的メカニズムはまだ完全には理解されていないため、現在利用可能な主要な治療法は、薬物療法、深部脳刺激6,7、遺伝子治療8、および細胞移植を通じて運動症状を緩和することを目指しています9。したがって、PDの発症メカニズムを解明し、PD10の罹患神経細胞の変性を予防または停止するための早期診断のための新しい方法論および新しい治療法を発見するための前臨床研究は不可欠です。
動物モデルは、実験室でヒトの病理をシミュレートするために広く使用されており、医学と科学の進歩に貢献しています11,12,13,14。しかし、動物モデルの正しい選択が研究の成功にとって不可欠であることを強調することが不可欠です。したがって、動物モデルは、3つの主要な側面において検証されなければならない:i)動物モデルがヒト病理の特徴を有していなければならない顔の妥当性;ii)動物モデルが確固たる理論的根拠を持たなければならない建設的妥当性。iii)動物モデルが臨床的治療と同様の方法で治療に応答しなければならない予測的妥当性。
現在、PDの動物モデルとして数匹の動物が用いられている。主なグループには、げっ歯類、霊長類、ミニブタ、イヌ、ネコなどの哺乳類、およびショウジョウバエやゼブラフィッシュなどの他のグループが含まれます。げっ歯類はPDの最も古典的な動物モデルであり、取り扱いとメンテナンスの容易さのために最も使用されています。さらに、PDの解剖学的構造と分子的、細胞的、薬理学的メカニズムは、げっ歯類とヒトで類似しています15。
Kinらが2019年に発表したレビューでは、2000年代にPDに使用された主要な動物モデル方法論を分析し、最も使用された動物モデルには6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)や1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)などの神経毒が含まれていることが判明しました。どちらの神経毒も、黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンにミトコンドリア調節不全を引き起こし、細胞死につながります16。もう1つの広く使用されているモデルは、PDの発症に関与する特定の遺伝子の変異による遺伝子操作を含み、ミトコンドリアの調節不全を引き起こす17。神経毒モデルは、治療薬の評価と比較に一般的に使用され、遺伝的モデルは予防療法および特発性PD15の開発を研究するために使用されます。
神経毒MPTPは、7人の患者がこの物質を使用し、重度のPD症状を示した後、1980年代半ばにパーキンソニズムを引き起こすことが発見された。症状に加えて、患者はL-DOPAによる治療に反応し、研究者らは分子をPDに直接リンクさせた。この症例が1986年に発表された後、何人かの研究者が前臨床PD研究でMPTPを使用し始めました18。研究者らは、MPTPが親油性分子であるため、血液脳関門(BBB)を通過してMPP + 19に変換されることを発見しました。この有毒物質はニューロン内部に蓄積し、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体1に損傷を与え、ドーパミン作動性ニューロンの死につながります20。
6-OHDA神経毒モデルは、196821年に黒質線条体経路のモノアミンニューロンの変性を誘導するために初めて使用された。6-OHDAモデルは、ドーパミン類似体であり、カテコールアミン含有細胞に対して毒性であるため、黒質線条体経路において神経変性を引き起こすために一般的に使用される。6-OHDAは、脳に入った後、ドーパミン作動性ニューロンにおいてドーパミントランスポーター(DAT)に取り込まれ、黒質線条体経路の変性につながる22。6-OHDAはBBBに浸透しないため、脳内定位注射によって直接投与されなければならない23。ノルアドレナリン再取り込み阻害剤は、しばしば6-OHDAマイクロインジェクションと組み合わされ、ノルアドレナリン作動性線維を保存し、ドーパミン作動性ニューロンのより選択的な変性を提供する24。
DATが6-OHDAを取り込んだ後、それはニューロンの細胞質ゾルに蓄積し、活性酸素種(ROS)を産生し、細胞死につながります15。6-OHDAの3つの異なる病変モデルが頻繁に使用される:i)SNc25,26に対する病変;ii)線条体への病変27,28;iii)MFB29、30に対する病変。線条体に引き起こされた病変は、SNpcにおけるドーパミン作動性ニューロンのゆっくりとした逆行性変性をもたらす。対照的に、SNpcおよびMFBで引き起こされた病変は、ニューロンの急速かつ全的な変性をもたらし、より進行したパーキンソン病症状をもたらす31。
6-OHDAの片側または両側注射は、ドーパミン作動性ニューロンにおいて神経変性を引き起こし得る。6-OHDAは、必ずしもニューロンに重度の損傷を引き起こすとは限らない。時には、注入は部分的な損傷をもたらし、PD32の初期段階をシミュレートするためにも使用される。一方的注射は、動物の運動障害を評価し、アンフェタミン/アポモルヒネ誘発回転およびステッピング試験などの試験を通じて細胞損失を予測するモデルの能力のために、より一般的に使用される29。バイラテラルインジェクションは、空間記憶と認識を評価するために最も使用されます33。
アンフェタミン/アポモルヒネ誘導回転試験は、黒質線条体経路における細胞喪失を予測するために一般的に使用される行動試験である。これは、ドーパミンアゴニストを繰り返し投与すると、6-OHDA病変動物における回転行動の激化をもたらすプロセスとして定義される34。回転挙動は、一方的に病変したげっ歯類におけるアンフェタミン誘発同側回転またはアポモルヒネ誘発対側回転を定量化することからなる。薬物誘発性の回転行動は、回転がヒトのPD症状に対応しておらず、耐性、感作、および「プライミング」などの変数によって影響を受ける可能性があるため、批判されている35。
プライミングは、これらの行動テストにおいて最も重要な要因の1つです。L-DOPAの単回投与が回転行動の失敗につながったいくつかの症例が報告されている36。さらに、アンフェタミン誘発試験とアポモルヒネ誘発試験の並行使用のための併用に関連するもう1つの重要な要因は、異なるシグナル伝達機構および経路の不活性化を反映して、異なる作用機序のために異なるエンドポイントを測定することである。さらに、アンフェタミン誘発試験は、50〜60%を超える黒質線条体病変を測定する方がより正確であるのに対し、アポモルヒネ誘発試験は80%を超える病変に対してより正確である37。
ステッピングテストは、ドーパミン作動性ニューロン変性および治療効果に関連する欠損を示す行動テストとして浮上している。これは、薬物誘発処置なしでドーパミン作動性ニューロンにおける6-OHDA病変によって引き起こされる無覚症の分析を可能にする。さらに、この試験は、Olssonらによって最初に記載された1995年以来、十分に確立され、一般的に使用されている。1999年、Chang et al.38 はまた、ステッピング試験におけるラットの性能を6-OHDAによって引き起こされる変性のレベルと分析および比較し、ステッピング試験でより悪いパフォーマンスを示した動物もドーパミン作動性ニューロンのより有意な変性を有することを見出した。
ステッピング試験は、6-OHDA病変ラットにおける重度のドーパミン作動性黒質線条体損傷を予測するための優れた方法である。証拠は、SNcにおけるドーパミン作動性喪失の程度が>90%である場合、ステッピング試験中に6-OHDA注入の対側前肢に運動欠損が現れることを示唆している39。本稿では、ラットのMFBへの6-OHDAの片側注入のための定位手術を行うために使用されるプロトコル、方法論、および材料、およびステッピング試験を介して毒素によって引き起こされるドーパミン作動性病変を予測する方法を説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
この論文は、MFB中の6-OHDAの片側微量注入のための手術を行うためのプロトコルを記載しており、黒質線条体経路のニューロンに堅牢な病変を引き起こし、動物に無動症を発生させることができる。また、ステッピング試験を実行するためのプロトコルは、病変の成功を証明し、前肢の無呼吸を評価するために使用することができる、容易に適用可能で非侵襲的な試験である。代表的な結果に?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、サンパウロ研究財団(FAPESP、助成金2017/00003-0)の支援を受けました。我々は、高等教育職員の改善のための調整(CAPES)に感謝する。アンソニー・R・ウェスト博士、ハインツ・シュタイナー博士、クエイ・Y・ツェン博士の支援とメンタリングに感謝します。
Materials
| 6-OHDA | Sigma Aldrich | H4381 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt®ion=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1 |
| 70% Alcohol | |||
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | 795437 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt®ion=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB |
| Cotton | |||
| Drill or tap | |||
| Gauze | |||
| Hamilton syringe 50 uL | Hamilton | 80539 | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539 |
| Imipramine | Alfa Aeser | J63723 | https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/ |
| Infusion pump | Insight | EFF-311 | https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/ |
| Ketamine (Dopalen) | Ceva | https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN | |
| Machine for trichotomy | |||
| Meloxicam (Maxicam 2% Ourofino) | Ourofino | https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/ | |
| Metal Disposal | |||
| Paper towels | |||
| Pentabiotic | Zoetis | https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx | |
| Plastic waste garbage can | |||
| Poly-antibiotic | Pentabiotic (Wealth) | ||
| Povidone-iodine | |||
| Scalpel and blades | |||
| Scissors | |||
| Scraper | |||
| Stereotaxic apparatus | Insight | EFF-331 | https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/ |
| Sterile saline solution | |||
| Swabs | |||
| Temperature probe | |||
| Timer | |||
| Tweezers | |||
| Xylazine (Anasedan) | Ceva | https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN |
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