Le modèle de rat 6-hydroxydopamine de la maladie de Parkinson
Summary
Le modèle de la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) est utilisé depuis des décennies pour faire progresser la compréhension de la maladie de Parkinson. Dans ce protocole, nous montrons comment effectuer des lésions nigrostriatales unilatérales chez le rat en injectant du 6-OHDA dans le faisceau médian du cerveau antérieur, évaluer les déficits moteurs et prédire les lésions à l’aide du test de pas.
Abstract
Les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson (MP) – bradykinésie, akinésie et tremblement au repos – sont des conséquences de la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta (SNc) et du déficit striatal dopaminergique. Les modèles animaux ont été largement utilisés pour simuler la pathologie humaine en laboratoire. Les rongeurs sont les modèles animaux les plus utilisés pour la MP en raison de leur facilité de manipulation et d’entretien. De plus, l’anatomie et les mécanismes moléculaires, cellulaires et pharmacologiques de la MP sont similaires chez les rongeurs et les humains. L’infusion de la neurotoxine, la 6-hydroxydopamine (6-OHDA), dans un faisceau médian du cerveau antérieur (MFB) de rats reproduit la destruction sévère des neurones dopaminergiques et simule les symptômes de la MP. Ce protocole montre comment effectuer la micro-injection unilatérale de 6-OHDA dans le MFB dans un modèle de de rat et montre les déficits moteurs induits par le 6-OHDA et les lésions dopaminergiques prédites à travers le test pas à pas. Le 6-OHDA provoque une altération significative du nombre d’étapes effectuées avec le membre antérieur controlatéral.
Introduction
Les principales caractéristiques neuropathologiques de la MP sont la neurodégénérescence progressive chronique des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta (SNc) et la présence de corps de Lewy contenant α-synucléine1. Comme les neurones dopaminergiques SNc projettent leurs axones dans le striatum par la voie nigrostriatale, la neurodégénérescence des neurones dans SNc entraîne un déficit dopaminergique dans le striatum2. L’absence de dopamine dans le striatum provoque un déséquilibre dans les activités des voies de contrôle moteur direct et indirect, responsable des principaux symptômes moteurs de la MP: akinésie (mouvement lent), bradykinésie (difficulté à commencer les mouvements), raideur musculaire et tremblements au repos3,4,5.
Comme les mécanismes moléculaires et physiologiques impliqués dans l’apparition de la MP ne sont pas encore entièrement compris, les principaux traitements actuellement disponibles cherchent à soulager les symptômes moteurs par le biais de pharmacothérapies, de stimulations cérébrales profondes6,7, de thérapies génétiques8 et de greffes de cellules9. Par conséquent, la recherche préclinique est fondamentale pour élucider les mécanismes impliqués dans l’apparition de la MP et découvrir de nouvelles méthodologies pour le diagnostic précoce et de nouvelles thérapies pour prévenir ou arrêter la dégénérescence des neurones affectés par PD10.
Les modèles animaux ont été largement utilisés pour simuler la pathologie humaine en laboratoire, contribuant à l’avancement de la médecine et de la science11,12,13,14. Cependant, il est essentiel de souligner que le choix correct du modèle animal est fondamental pour le succès de l’étude. Par conséquent, le modèle animal doit être validé sous trois aspects principaux: i) la validité faciale, dans laquelle le modèle animal doit présenter les caractéristiques de la pathologie humaine; ii) la validité constructive, dans laquelle le modèle animal doit avoir une base théorique solide; et iii) la validité prédictive, dans laquelle les modèles animaux doivent répondre aux traitements de la même manière que le traitement clinique.
Actuellement, plusieurs animaux sont utilisés comme modèles animaux pour la MP. Les principaux groupes comprennent les mammifères, tels que les rongeurs, les primates, les minipigs, les chiens et les chats, et d’autres groupes tels que la drosophile et le poisson-zèbre. Les rongeurs sont le modèle animal le plus classique pour la MP et le plus utilisé en raison de leur facilité de manipulation et d’entretien. De plus, l’anatomie et les mécanismes moléculaires, cellulaires et pharmacologiques de la MP sont similaires chez les rongeurs et les humains15.
Une revue publiée par Kin et ses collègues en 2019 a analysé les principales méthodologies de modèle animal utilisées pour la MP dans les années 2000 et a révélé que le modèle animal le plus utilisé impliquait des neurotoxines telles que la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) et le 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Les deux neurotoxines provoquent un dérèglement mitochondrial dans les neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale, entraînant la mort cellulaire16. Un autre modèle largement utilisé implique une manipulation génétique par mutation dans des gènes spécifiques impliqués dans l’apparition de la MP, provoquant une dérégulation mitochondriale17. Les modèles de neurotoxines sont couramment utilisés pour évaluer et comparer les thérapies, tandis que les modèles génétiques sont utilisés pour étudier le développement de thérapies préventives et de PD15 idiopathique.
La neurotoxine MPTP a été découverte pour causer le parkinsonisme au milieu des années 1980 après que sept patients ont utilisé la substance et présenté des symptômes graves de MP. En plus des symptômes, les patients ont répondu au traitement par L-DOPA, ce qui a amené les chercheurs à lier la molécule directement à la MP. Après la publication du cas en 1986, plusieurs chercheurs ont commencé à utiliser le MPTP dans la recherche préclinique sur la MP18. Les chercheurs ont découvert qu’étant une molécule lipophile, le MPTP peut traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) et être converti en MPP + 19. Cette substance toxique s’accumule à l’intérieur des neurones et endommage le complexe 1 de la chaîne respiratoire mitochondriale, entraînant la mort des neurones dopaminergiques20.
Le modèle de neurotoxine 6-OHDA a été utilisé pour la première fois pour induire la dégénérescence des neurones monoamines de la voie nigrostriatale en 196821. Le modèle 6-OHDA est couramment utilisé pour provoquer une neurodégénérescence dans la voie nigrostriatale car il s’agit d’un analogue de la dopamine et toxique pour les cellules contenant des catécholamines. Après que le 6-OHDA pénètre dans le cerveau, il peut être absorbé par le transporteur de dopamine (DAT) dans les neurones dopaminergiques, entraînant une dégénérescence de la voie nigrostriatale22. Étant donné que le 6-OHDA ne pénètre pas dans le BHE, il doit être administré directement par injection stéréotaxique intracérébrale23. Un inhibiteur de la recapture de la noradrénaline est souvent associé à une microinjection de 6-OHDA pour préserver les fibres noradrénergiques et fournir une dégénérescence plus sélective des neurones dopaminergiques24.
Une fois que le DAT a absorbé le 6-OHDA, il s’accumulera dans le cytosol des neurones, produisant des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et entraînant la mort cellulaire15. Trois modèles de lésions différentes de 6-OHDA sont fréquemment utilisés: i) lésions du SNc25,26; ii) lésions du striatum27,28; iii) lésions du MFB29,30. Les lésions causées dans le striatum entraînent une dégénérescence lente et rétrograde des neurones dopaminergiques dans le SNpc. En revanche, les lésions causées dans le SNpc et le MFB entraînent une dégénérescence rapide et totale des neurones, entraînant des symptômes parkinsoniens plus avancés31.
L’injection unilatérale ou bilatérale de 6-OHDA peut provoquer une neurodégénérescence dans les neurones dopaminergiques. 6-OHDA ne cause pas toujours de graves dommages aux neurones; parfois, l’injection entraîne des dommages partiels, qui sont également utilisés pour simuler les premiers stades de PD32. L’injection unilatérale est plus couramment utilisée en raison de la capacité du modèle à évaluer les déficits moteurs de l’animal et à prédire la perte cellulaire grâce à des tests tels que la rotation induite par l’amphétamine / apomorphine et le test par étapes29. Les injections bilatérales sont les plus utilisées pour évaluer la mémoire spatiale et la reconnaissance33.
Le test de rotation induit par l’amphétamine / apomorphine est un test comportemental couramment utilisé pour prédire la perte cellulaire dans la voie nigrostriatale. Il est défini comme un processus dans lequel l’administration répétée d’agonistes de la dopamine conduit à une intensification du comportement de rotation chez les animaux présentant des lésions 6-OHDA34. Le comportement de rotation consiste à quantifier la rotation ipsilatérale induite par les amphétamines ou les virages controlatéraux induits par l’apomorphine chez les rongeurs sectionnés unilatéralement. Le comportement de rotation induit par les médicaments a été critiqué parce que la rotation ne correspond pas aux symptômes de la MP chez l’homme et peut être affectée par des variables telles que la tolérance, la sensibilisation et l’amorçage 35.
L’amorçage est l’un des facteurs les plus critiques dans ces tests comportementaux. Certains cas ont été rapportés dans lesquels une dose unique de L-DOPA a conduit à une défaillance des comportements de rotation36. En outre, un autre facteur critique lié à l’application combinée du test induit par les amphétamines et du test induit par l’apomorphine pour une utilisation parallèle est qu’ils mesurent différents paramètres en raison de différents mécanismes d’action, reflétant l’inactivation de différents mécanismes et voies de signalisation. De plus, le test induit par les amphétamines est plus précis pour mesurer les lésions nigrostriatales supérieures à 50-60%, tandis que le test induit par l’apomorphine est plus précis pour les lésions supérieures à 80%37.
Le test pas à pas est apparu comme un test comportemental qui indique les déficits liés à la dégénérescence des neurones dopaminergiques et aux effets thérapeutiques. Il permet l’analyse de l’akinésie causée par une lésion 6-OHDA dans les neurones dopaminergiques sans procédure induite par un médicament. De plus, le test est bien établi et couramment utilisé depuis 1995, date à laquelle il a été décrit pour la première fois par Olsson et al.35. En 1999, Chang et al.38 ont également analysé et comparé la performance des rats dans le test de pas avec le niveau de dégénérescence causée par le 6-OHDA et ont constaté que les animaux qui ont obtenu de moins bons résultats dans le test de pas avaient également une dégénérescence plus significative des neurones dopaminergiques.
Le test pas à pas est une excellente méthode pour prédire les dommages nigrostriataux dopaminergiques graves chez les rats sectionnés au 6-OHDA. Les preuves suggèrent que des déficits moteurs apparaissent dans le membre antérieur controlatéral de la perfusion de 6-OHDA pendant le test de pas lorsque le degré de perte dopaminergique dans SNc est de >90%39. Cet article décrit les protocoles, les méthodologies et les matériaux utilisés pour effectuer une chirurgie stéréotaxique pour l’infusion unilatérale de 6-OHDA dans le MFB de rats et comment prédire les lésions dopaminergiques causées par la toxine à travers le test d’étape.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit un protocole de chirurgie pour la microinfusion unilatérale de 6-OHDA dans la MFB, capable de provoquer des lésions robustes dans les neurones de la voie nigrostriatale et de générer une akinésie chez l’animal. Le protocole d’exécution du test pas à pas, un test facile à appliquer et non invasif qui peut être utilisé pour prouver le succès des lésions et évaluer l’akinésie des membres antérieurs, est également décrit. Comme présenté dans les résultats représentatifs, les ani…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP, subvention 2017/00003-0). Nous sommes reconnaissants pour la Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES). Nous remercions le Dr Anthony R. West, le Dr Heinz Steiner et le Dr Kuei Y. Tseng pour leur soutien et leur mentorat.
Materials
| 6-OHDA | Sigma Aldrich | H4381 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt®ion=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1 |
| 70% Alcohol | |||
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | 795437 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt®ion=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB |
| Cotton | |||
| Drill or tap | |||
| Gauze | |||
| Hamilton syringe 50 uL | Hamilton | 80539 | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539 |
| Imipramine | Alfa Aeser | J63723 | https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/ |
| Infusion pump | Insight | EFF-311 | https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/ |
| Ketamine (Dopalen) | Ceva | https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN | |
| Machine for trichotomy | |||
| Meloxicam (Maxicam 2% Ourofino) | Ourofino | https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/ | |
| Metal Disposal | |||
| Paper towels | |||
| Pentabiotic | Zoetis | https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx | |
| Plastic waste garbage can | |||
| Poly-antibiotic | Pentabiotic (Wealth) | ||
| Povidone-iodine | |||
| Scalpel and blades | |||
| Scissors | |||
| Scraper | |||
| Stereotaxic apparatus | Insight | EFF-331 | https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/ |
| Sterile saline solution | |||
| Swabs | |||
| Temperature probe | |||
| Timer | |||
| Tweezers | |||
| Xylazine (Anasedan) | Ceva | https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN |
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