イン・シトゥ メサネフォロス発生時のゼブラフィッシュ幼虫と若年期のハイブリダイゼーション
Summary
ゼブラフィッシュは腎臓の発達を理解するための重要なモデルです。ここで、イン ・シチュハイブリ ダイゼーションプロトコルは、メサネフォロスの発生中にゼブラフィッシュ幼虫および若年者の遺伝子発現を検出するように最適化される。
Abstract
ゼブラフィッシュは、その生涯で2つの腎臓構造を形成します。この発症(胚性腎臓)は、胚発生時に形成され、受精後2日で機能し始める。2つのニーフロンだけで構成され、体重増加のためにより多くの腎機能が必要になるまで、幼虫の生活の間に唯一の腎臓として機能する傾向があります。この高い需要に対処するために、メソネフロス(成人腎臓)は変態の間に形成し始める。新しい一次ニーフロンは、傾向のある咽頭に融合し、接続されたルーメンを形成する。次に、二次ニーフロンは一次のネフロンに融合し(など)メソネフロスに分岐ネットワークを作ります。研究の大半は、胚の使用の容易さのために、傾向に焦点を当てています。したがって、 メサネフォロスの開発をよりよく理解するために、古くて大きな幼虫と若年魚を研究する技術を開発する必要があります。.ここでは、遺伝子発現解析のための in in in 遺伝子発現促進プロトコルが、プローブの浸透、プローブおよび抗体の洗浄、およびメサネフロスをよりよく可視化するための顔料の漂白に最適化されている。 Tg(lhx1a-EGFP) トランスジェニックラインは、前駆細胞および新生性ネフロンの遠位細管を標識するために使用されます。このプロトコルは、メサネフロス研究のギャップを埋めます。これは、新しい腎臓組織がどのように形成され、既存のニーフロンと統合し、再生療法に関する洞察を提供するかを理解するための重要なモデルです。
Introduction
ゼブラフィッシュ胚は、その小さなサイズ、透明性、利用可能なツール、および最大5日間の給餌なしで生存のために組織の発達を研究するための重要なモデルです1,2。これは、ゼブラフィッシュと哺乳類の間の腎臓の発達と保全の理解に大きく貢献してきました3,4,5.腎臓は、体液性恒常性を維持し、血液を濾過し、廃棄物を排泄する上で不可欠な役割を果たす6。腎臓の機能単位である腎は、長い細管に接続された血液フィルターを含む。ゼブラフィッシュでは、2つの腎臓構造がその生涯を通じて形成される。発症初期の初期の段階で最初に形成される傾向がある(一時的な胚性腎臓)。それは前部後軸に沿って走る2つの腎で構成され、受精後2日(dpf)の周りに機能する。この傾向の有用性は、その単純性にあり、ほとんど線形で視覚化しやすい2つのニーフロンを持っています(ただし、近位畳の尿細管は3 dpfでコイルし始めます)。これは中間中期からその初期の開発の研究を促進しただけでなく、セグメンテーションパターンおよび管状の修理7,8を促進した。
ゼブラフィッシュの有用性は、黄身が減少し、幼虫が水生系での給餌に依存する5dpf後に制限される。生後約2週間で、幼虫は若年に変態を受け、新しい組織が形成され、古い組織が失われたり再編成されたりする。これはまた、メソネフロス(永久成人腎臓)が10,11,12を形成する場合である。最初の成人のネフロンは、第六のスマイトの近くに形成され、そして、傾向のある初期の尿細管と融合する。追加のニーフロンは、最初はこの位置に後部を追加されますが、後で前部に向かっても追加されます。この最初の波の主なネフロンは、傾向のある尿細管に融合し、廃棄物を堆積させるために共通のルーメンを共有しています。二次ニーフロンは次の波で形成され、一次ネフロンに融合する。この繰り返しのプロセスは、哺乳類の腎臓にやや似た分岐しているメソネフロスを作成します。おそらく、傾向のあるフロスは最終的にその尿細管の同一性を失い、すべてのネフロンが彼らの廃棄物を排出する2つの主要な収集ダクトになります13。
最初の成体腎の形成に先立ち、単一の前駆細胞は、〜4mm(全長)幼虫(〜10dpf)で出現し始める。 Tg(lhx1a-EGFP) トランスジェニックラインに印が付いているこれらの細胞は、傾向に付着し、腎生原の将来の部位に移行するように見える。単一の細胞はクラスターに合体し、新しいnephrons12に分化する。これらの細胞がどこに存在するか、または彼らがメサネ咽頭形成の発症前にどのような遺伝子を発現するかは不明である。
メソネフロスの発達を理解することは、哺乳類腎臓に対する洞察を、傾向のある人にはできない方法で提供する。これらには、単一の前駆細胞からのネフローゲン凝集体の形成、既存のネフロンとの新しいネフロンの機能的統合、および分岐形態形成が含まれる。しかし、胚後の発達を研究することには限界があります。幼虫は大きな大きさと色素沈着のため、透明度が低くなります。発達タイムラインは個々の動物間で同期的ではなく、摂食や混雑などの環境要因に大きく依存しています。ノックダウン試薬は存在するが、胚15に比べて幼虫の効果は低い。本プロトコルでは、ゼブラフィッシュメソネフロスの発生時に遺伝子発現を決定するin in situハイブリダイゼーション法について説明する。いくつかのステップは、メゾンフォロスの可視化とプローブおよび抗体の浸透および洗浄を増加させるために最適化されています。Tg(lhx1a-EGFP)トランスジェニックラインは、EGFP用プローブとともに、単一の前駆細胞、ネフローゲン凝集体、および新生ネフロンの遠位細管を標識するために使用されます。この方法は、メソネフォロスの開発のより深い理解と再生療法への洞察を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する in situ ハイブリダイゼーション法は、メソネフォロスの開発を研究することを目的としています。しかし、腸、神経系、スケール、色素沈着などの変態中の他の組織や臓器の発達を研究するために適用することができます。プローブは、トランスジェニックラインの内因性遺伝子または蛍光マーカーに対して生成され得る。
幼虫?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
資金は、ペンシルベニア科学アカデミー、ペンシルベニア州生物学者の連邦、ペンシルベニア大学(大学院研究研究部、生物学部、シンシア・サシャク学部優秀生物学基金)によって提供されました。 Tg(lhx1a-EGFP) トランスジェニックラインは、ニール・フクリード博士(ピッツバーグ大学)によって提供されました。
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
Referências
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