In situ Hybridisering i sebrafisk larver og ungdommer under Mesonephros Utvikling

Summary

Sebrafisken er en viktig modell for å forstå nyreutvikling. Her er en in situ hybridiseringsprotokoll optimalisert for å oppdage genuttrykk i sebrafisk larver og ungdommer under mesonephros utvikling.

Abstract

Sebrafisken danner to nyrestrukturer i sin levetid. Pronephros (embryonal nyre) dannes under embryonal utvikling og begynner å fungere ved 2 dager etter befruktning. Bestående av bare to nephrons, fungerer pronephros som den eneste nyre under larvallivet til mer nyrefunksjon er nødvendig på grunn av den økende kroppsmassen. For å takle denne høyere etterspørselen begynner mesonephros (voksen nyre) å danne seg under metamorfose. Den nye primære nephrons sikringen til pronephros og danner tilkoblede lumen. Deretter smelter sekundære nephrons til primære (og så videre) for å skape et forgreningsnettverk i mesonephros. Det store flertallet av forskningen er fokusert på pronephros på grunn av den enkle å bruke embryoer. Dermed er det behov for å utvikle teknikker for å studere eldre og større larver og juvenil fisk for bedre å forstå mesonephros utvikling. Her er en in situ hybridiseringsprotokoll for genuttrykksanalyse optimalisert for sondeinntrengning, vasking av sonder og antistoffer, og bleking av pigmenter for bedre å visualisere mesonephros. Den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) brukes til å merke stamceller og distale tubuli av nascent nephrons. Denne protokollen fyller et gap i mesonephros forskning. Det er en avgjørende modell for å forstå hvordan nye nyrevev dannes og integreres med eksisterende nefroner og gir innsikt i regenerative terapier.

Introduction

Sebrafiskembryoet er en viktig modell for å studere vevsutvikling på grunn av sin lille størrelse, gjennomsiktighet, tilgjengelige verktøy og overlevelse uten fôring i opptil fem ^dager1,2. Det har i stor grad bidratt til forståelsen av nyreutvikling og bevaring mellom sebrafisk og ^{pattedyr3,4,5}. Nyrene spiller en viktig rolle i å opprettholde væske homeostase, filtrere blodet og skille ut ^avfall6. Nephron, den funksjonelle enheten av nyrene, består av et blodfilter koblet til en lang tubule. I sebrafisk dannes to nyrestrukturer gjennom hele livet. Pronephros (den midlertidige embryonale nyren) dannes først under tidlig utvikling. Den består av to nephrons som løper langs den fremre bakre aksen og blir funksjonell på rundt 2 dager etter befruktning (dpf). Nytten av pronephros ligger i sin enkelhet, og har bare to nephrons som for det meste er lineære og enkle å visualisere (selv om den proksimale konvoluterte tubule begynner å spole på tre dpf)³. Dette har lagt til rette for ikke bare studier av den tidlige utviklingen fra mellomliggende mesoderm, men også segmenteringsmønsteret og tubule ^{reparasjon7,8}.

Nytten av sebrafisk blir begrenset etter fem dpf, når eggeplommen er redusert og larvene er avhengige av fôring i ^{vannsystemet9}. Rundt 2 uker gammel gjennomgår larvene metamorfose til ungdommer, hvor nye vev dannes og gamle vev går tapt og / eller ^{omorganiseres9}. Dette er også når mesonephros (den permanente voksne nyre) danner10,11,12. Den første voksne nephron dannes nær den sjette somite, og smelter sammen med den distale tidlige tubule av pronephros. Ytterligere nephrons legges til bakre til denne posisjonen i utgangspunktet, men også mot fremre senere. De primære nephrons i denne første bølgesikringen til tubuliene til pronephros og deler en felles lumen for å deponere avfallet. Sekundære nephrons dannes i neste bølge og smelter til primære nephrons. Denne gjentakende prosessen skaper en mesonephros som er forgrenet, noe som ligner pattedyrets nyre. Antagelig mister de utsattephros til slutt sin tubule identitet og blir to store samlekanaler der alle nephrons drenerer ^avfallet13.

Før dannelsen av den første voksne nephron begynner enkle stamceller å vises i ~ 4 mm (total lengde) larver (~ 10 dpf). Disse cellene, som er merket i Tg (lhx1a-EGFP) transgene linjen, holder seg til pronephros og ser ut til å migrere til fremtidige steder av nefogenese. Enkeltcellene samles i klynger, som skiller seg ut i nye ^nephrons12. Det er uklart hvor disse cellene ligger eller hvilke gener de uttrykker før mesonephrogenesis.

Å forstå mesonephros utvikling gir innsikt i pattedyr nyre på måter som pronephros ikke kan. Disse inkluderer dannelsen av nephrogenic aggregater fra enkelt forfedre celler, funksjonell integrasjon av nye nephrons med eksisterende, og forgrening morphogenesis. Det er imidlertid begrensninger for å studere postembryonisk utvikling. Larvene er mindre gjennomsiktige på grunn av deres større størrelse og har pigmentering. Utviklingstidslinjen er ikke synkron blant enkeltdyr og er svært avhengig av miljøfaktorer som fôring og ^trengsel9,14. Selv om knockdown reagenser eksisterer, er de mindre effektive i larver sammenlignet med ^embryoer15. I denne protokollen beskrives en in situ hybridiseringsmetode for å bestemme genuttrykk under sebrafisk mesonephros utvikling. Flere trinn er optimalisert for å øke visualiseringen av mesonephros og penetrasjon og vasking av sonden og antistoffet. Den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) brukes sammen med en sonde for EGFP for å merke enkle stamceller, nefrogene aggregater og de distale tubuliene av nascent nephrons. Denne metoden vil gi en dypere forståelse av mesonephros utvikling og innsikt i regenerative terapier.

Protocol

Bruken av sebrafisk larver og juveniler er godkjent av IUP IACUC (protokoll #02-1920, #08-1920). Detaljer om løsningsinnholdet er oppført i materialfortegnelser. 1. Heve larver MERK: Det vil ta opptil 21 dager eller mer å heve larver og ungdommer til interessestadiet. Sett opp voksen sebrafisk for å mate ved å legge til 1 mannlig og 1 kvinnelig fisk i en parringstank sent på ettermiddagen etter deres siste måltid.MERK: Ikke alle…

Representative Results

Ved hjelp av den transgene linjen Tg(lhx1a-EGFP) ble det demonstrert at denne in situ hybridiseringsprotokollen er effektiv i merking av nyreforfederceller og ulike nephronstrukturer under mesonephros utvikling. Som forventet er sentralnervesystemet også merket i denne transgene linjen (ikke vist). Den første mesonephric nephron dannes på ca 5,2 mm, dorsal til pronephros (figur 2A), og distal tubule av denne nephron er merket av EGFP10,12</su…

Discussion

In situ hybridiseringsmetoden beskrevet her er rettet mot å studere mesonephros utvikling. Det kan imidlertid brukes til å studere utviklingen av andre vev og organer under metamorfose, som tarm, nervesystem, skalaer og ^{pigmentering14}. Sonder kan genereres for endogene gener eller fluorescerende markører i transgene linjer.

Det er viktig for larvene å forbli intakte for å observere organer og vev i sin opprinnelige sammenheng. For å beholde vevsintegritet…

Materials

Anti-fluorescein antibody	Roche/Sigma-Aldrich	11426338910
Bleaching solution			0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
Blocking reagent	Roche/Sigma-Aldrich	11096176001	Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction
Cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549	100 μm
E3 medium			5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue
Eyelash manipulator	Fisher Scientific	NC1083208	Use to manipulate larvae
Fixing solution			4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down
Fluorescein probe synthesis	Roche/Sigma-Aldrich	11685619910
Glass vial	Fisher Scientific	03-338B
Hatchfry encapsulation	Argent
Hyb- solution			50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ solution			HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin
MAB (10X)			1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT			1X MAB, 0.1% Tween-20
Maleic acid	Sigma-Aldrich	M0375
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127
PBS (10X)			8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST			1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST2			1X PBS, 0.2% Tween-20
Powder food			Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P5568	Use to permeabilize larvae
Proteinase K solution			20  μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST
Spirulina microfine powder	Argent
SSC (20X)			3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave
SSCT (0.2X)			Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X)			Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer			100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20
Staining solution			200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer
Stopping solution			1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST
Torula (yeast) RNA	Sigma-Aldrich	R6625
Tricaine	Sigma Aldrich	E10521	2%, pH 7
Wash buffer			50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20