In situ Hybridisering hos zebrafisk larver och ungdomar under Mesonephros utveckling
Summary
Zebrafisken är en viktig modell för att förstå njurutveckling. Här är ett in situ hybridiseringsprotokoll optimerat för att upptäcka genuttryck hos zebrafisklarver och ungdomar under mesonephros utveckling.
Abstract
Zebrafisken bildar två njurstrukturer under sin livstid. Pronephros (embryonal njure) bildas under embryonal utveckling och börjar fungera vid 2 dagar efter befruktning. Bestående av endast två nefrorer fungerar pronephros som den enda njuren under larvlivet tills mer njurfunktion krävs på grund av den ökande kroppsmassan. För att klara av denna högre efterfrågan börjar mesonephros (vuxen njure) bildas under metamorfos. De nya primära nefronerna smälter till benägna frros och bildar anslutna lumen. Sedan smälter sekundära nefrooner till primära (och så vidare) för att skapa ett förgreningsnätverk i mesonephros. Den stora majoriteten av forskningen är inriktad på benägna att använda embryon. Således finns det ett behov av att utveckla tekniker för att studera äldre och större larver och ungfisk för att bättre förstå mesonephros utveckling. Här är ett in situ hybridiseringsprotokoll för genuttrycksanalys optimerat för sondpenetration, tvättning av sonder och antikroppar och blekning av pigment för att bättre visualisera mesonephros. Den transgena linjen Tg(lhx1a-EGFP) används för att märka stamceller och distala tubuler av gryende nefroner. Detta protokoll fyller en lucka i mesonephros forskning. Det är en viktig modell för att förstå hur nya njurvävnader bildas och integreras med befintliga nefross och ge insikter om regenerativa terapier.
Introduction
Zebrafiskembryon är en viktig modell för att studera vävnadsutveckling på grund av dess lilla storlek, transparens, tillgängliga verktyg och överlevnad utan utfodring i upp till fem dagar1,2. Det har i hög grad bidragit till förståelsen av njurutveckling och bevarandet mellan zebrafisk och däggdjur3,4,5. Njuren spelar en viktig roll för att upprätthålla flytande homeostas, filtrera blodet och utsöndra avfall6. Nefron, njurens funktionella enhet, består av ett blodfilter anslutet till en lång tubule. I zebrafisk bildas två njurstrukturer under hela sitt liv. Pronephros (den tillfälliga embryonala njuren) bildas först under tidig utveckling. Den består av två nefrorier som löper längs den främre bakre axeln och blir funktionell vid cirka 2 dagar efter befruktning (dpf). Nyttan av pronephros ligger i dess enkelhet, med bara två nefror som mestadels är linjära och lätta att visualisera (även om den proximala invecklade tubule börjar spola vid tre dpf)3. Detta har underlättat inte bara studier av dess tidiga utveckling från den mellanliggande mesodermen, men också segmenteringsmönstret och tubulereparation7,8.
Nyttan av zebrafisk blir begränsad efter fem dpf, när äggulan minskar och larverna förlitar sig på utfodring i vattensystemet9. Vid cirka 2 veckors ålder genomgår larverna metamorfos till ungdomar, där nya vävnader bildas och gamla vävnader går förlorade och/ eller omorganiseras9. Detta är också när mesonephros (den permanenta vuxna njuren) bildar10,11,12. Den första vuxna nefron bildas nära den sjätte somiten och smälter samman med den distala tidiga tubuleen hos pronephros. Ytterligare nephrons läggs till bakre till denna position inledningsvis, men också mot den främre senare. De primära nefronerna i denna första våg smälter till tubules av pronephros och delar en gemensam lumen för att deponera sitt avfall. Sekundära nefrostrar bildas i nästa våg och smälter till primära nefroner. Denna reiterativa process skapar en mesonephros som är förgrenad, något lik däggdjurs njuren. Förmodligen förlorar pronephros så småningom sin tubule identitet och blir två stora samla kanaler där alla nefroner dränerar sitt avfall13.
Före bildandet av den första vuxna nefroronen börjar enstaka stamceller dyka upp i ~4 mm (total längd) larver (~ 10 dpf). Dessa celler, som är markerade i Tg (lhx1a-EGFP) transgena linjen, följer pronephros och verkar migrera till framtida platser för nefrogenes. De enstaka cellerna förenas till kluster, som skiljer sig åt i nya nefros12. det är oklart var dessa celler bor eller vilka gener de uttrycker före uppkomsten av mesonephrogenesis.
Att förstå mesonephros utveckling ger insikter om däggdjurs njuren på sätt som benägnaphros inte kan. Dessa inkluderar bildandet av nefrogena aggregat från enstaka stamceller, funktionell integration av nya nefros med befintliga och förgrening av morfogenes. Det finns dock begränsningar för att studera postembryonic utveckling. Larverna är mindre transparenta på grund av sin större storlek och med pigmentering. Den utvecklingsmässiga tidslinjen är inte synkron bland enskilda djur och är i hög grad beroende av miljöfaktorer, såsom utfodring och trängsel9,14. Även om knockdown reagenser finns, är de mindre effektiva i larver jämfört med embryon15. I detta protokoll beskrivs en in situ hybridisering metod för att bestämma gen uttryck under zebrafish mesonephros utveckling beskrivs. Flera steg är optimerade för att öka visualiseringen av mesonephros och penetration och tvättning av sonden och antikroppen. Den transgena linjen Tg(lhx1a-EGFP) används tillsammans med en sond för EGFP för att märka enstaka stamceller, nefrogena aggregat och distala tubuler av gryende nefrorer. Denna metod kommer att ge en djupare förståelse för mesonephros utveckling och insikt i regenerativa terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
In situ hybridiseringsmetoden som beskrivs här syftar till att studera mesonephros utveckling. Det kan dock tillämpas för att studera utvecklingen av andra vävnader och organ under metamorfos, såsom tarm, nervsystem, vågar och pigmentering14. Sonder kan genereras för endogena gener eller fluorescerande markörer i transgena linjer.
Det är viktigt att larverna förblir intakta för att observera organen och vävnaderna i sitt ursprungliga sammanhang. Fö…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering tillhandahölls av Pennsylvania Academy of Science och Commonwealth of Pennsylvania Biologists och Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology och Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). Den transgena linjen Tg(lhx1a-EGFP) tillhandahölls av Dr. Neil Hukriede (University of Pittsburgh).
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
Referências
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish – emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al. Development of the zebrafish mesonephros. Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. . The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
