In Situ Mesonephros Gelişimi Sırasında Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Melezleme
Summary
Zebra balığı böbrek gelişimini anlamak için önemli bir modeldir. Burada, mezonephros gelişimi sırasında zebra balığı larvalarında ve yavrularda gen ekspresyonunu tespit etmek için bir in situ melezleme protokolü optimize edilmiştir.
Abstract
Zebra balığı ömrü boyunca iki böbrek yapısı oluşturur. Pronephros (embriyonik böbrek) embriyonik gelişim sırasında oluşur ve döllenmeden 2 gün sonra çalışmaya başlar. Sadece iki nefrondan oluşan pronephros, artan vücut kütlesi nedeniyle daha fazla böbrek fonksiyonu gerekli olana kadar larva yaşamı boyunca tek böbrek görevi görür. Bu yüksek taleple başa çıkmak için, metamorfoz sırasında mezonephros (yetişkin böbrek) oluşmaya başlar. Yeni birincil nefronlar pronephros’a kaynaşır ve bağlı lümenler oluşturur. Daha sonra, ikincil nefronlar, mezonephros’ta bir dallanma ağı oluşturmak için birincil olanlara (vb.) kaynaşır. Araştırmaların büyük çoğunluğu embriyo kullanma kolaylığı nedeniyle pronephros üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu nedenle, mezonephros gelişimini daha iyi anlamak için daha yaşlı ve daha büyük larvaları ve yavru balıkları incelemek için teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Burada, gen ekspresyon analizi için bir in situ hibridizasyon protokolü, prob penetrasyonu, probların ve antikorların yıkanması ve mezomünleri daha iyi görselleştirmek için pigmentlerin ağartılması için optimize edilmiştir. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı, progenitör hücreleri ve nascent nephronların distal tübüllerini etiketlemek için kullanılır. Bu protokol mesonephros araştırmalarındaki boşluğu dolduruyor. Yeni böbrek dokularının mevcut nefronlarla nasıl oluştuğunu ve bütünleşip yenileyici tedaviler hakkında fikir verdiğini anlamak için çok önemli bir modeldir.
Introduction
Zebra balığı embriyosu, küçük boyutu, şeffaflığı, mevcut araçları ve beş güne kadar beslenmeden hayatta kalması nedeniyle doku gelişimini incelemek için önemli bir modeldir1,2. Böbrek gelişiminin anlaşılmasına ve zebra balıkları ile memeliler arasındaki korumanın korunmasına büyük katkıda bulunmuştur3,4,5. Böbrek, sıvı homeostazını korumada, kanı filtrelemede ve atıkların atılmasında önemli bir rol oynar6. Böbreğin fonksiyonel birimi olan nefron, uzun bir tübüle bağlı bir kan filtresinden oluşur. Zebra balıklarında, yaşamı boyunca iki böbrek yapısı oluşur. Pronephros (geçici embriyonik böbrek) ilk olarak erken gelişim sırasında oluşur. Ön-arka eksen boyunca çalışan iki nefrondan oluşur ve döllenmeden (dpf) yaklaşık 2 gün sonra işlevsel hale gelir. Pronephros’un faydası basitliğinde yatmaktadır, çoğunlukla doğrusal ve görselleştirilmesi kolay sadece iki nefrona sahiptir (proksimal dolambaçlı tübül üç dpf’de sarmal yapmaya başlasa da)3. Bu sadece ara mezodermden erken gelişiminin çalışmalarını değil, aynı zamanda segmentasyon deseni ve tübül onarımını da kolaylaştırmıştır7,8.
Zebra balıklarının kullanışlılığı, yumurta sarısı azaldığında ve larvalar su sisteminde beslenmeye dayandığında beş dpf’den sonra sınırlı hale gelir9. Yaklaşık 2 haftalıkken larvalar, yeni dokuların oluştuğu ve eski dokuların kaybolduğu ve / veya yeniden düzenlendiği gençlere metamorfoz geçirir9. Bu aynı zamanda mezonephros (kalıcı yetişkin böbreği) 10,11,12 oluşturur. İlk yetişkin nefron altıncı somit yakınında oluşur ve pronephros distal erken tübül ile kaynaşır. Ek nefronlar başlangıçta bu konuma arka olarak eklenir, ancak daha sonra ön konuma da eklenir. Bu ilk dalgadaki birincil nefronlar pronephros tübüllerine kaynaşır ve atıklarını biriktirmek için ortak bir lümeni paylaşırlar. İkincil nefronlar bir sonraki dalgada oluşur ve birincil nefronlara kaynaşır. Bu tekrarlayıcı süreç, memeli böbreği gibi dallı bir mezonephros oluşturur. Muhtemelen, pronephros sonunda tübüle kimliğini kaybeder ve tüm nefronların atıklarını boşalttığı iki büyük toplama kanalı haline gelir13.
İlk yetişkin nefron oluşumundan önce, tek ata hücreleri ~4 mm (toplam uzunluk) larvalarda (~10 dpf) görünmeye başlar. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik çizgisinde işaretlenen bu hücreler, proneforolara yapışır ve gelecekteki nefrogenez bölgelerine göç eder gibi görünmektedir. Tek hücreler kümeler halinde birleşir ve bu da yeni nefronlara dönüşür12. Bu hücrelerin nerede yaşadığı veya mezonephrogenez başlangıcından önce hangi genleri ifade ettikleri belirsizdir.
Mezoneforos gelişimini anlamak, memeli böbreği hakkında pronephros’un yapamayacağı şekilde içgörüler sağlar. Bunlar arasında tek progenitör hücrelerden nefrojenik agregaların oluşumu, yeni nefronların mevcutlarla fonksiyonel entegrasyonu ve dallanma morfogenezi saydır. Bununla birlikte, postembriyonik gelişimi incelemek için sınırlamalar vardır. Larvalar daha büyük boyutları ve pigmentasyonları nedeniyle daha az şeffaftır. Gelişimsel zaman çizelgesi bireysel hayvanlar arasında senkronize değildir ve beslenme ve kalabalık oluşturma9,14 gibi çevresel faktörlere oldukça bağlıdır. Nakavt reaktifleri mevcut olmasına rağmen, larvalarda embriyolara kıyasla daha az etkilidirler15. Bu protokolde zebra balığı mezoteforos gelişimi sırasında gen ekspresyonunu belirlemek için yerinde melezleme yöntemi tanımlanmıştır. Mezomreforoların görselleştirilmesini ve prob ve antikorun penetrasyonunu ve yıkanmasını artırmak için çeşitli adımlar optimize edilmiştir. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı, EGFP’nin tek progenitör hücreleri, nefrojenik agregaları ve nascent nephronların distal tübüllerini etiketlemesi için bir prob ile birlikte kullanılır. Bu yöntem, mezometroların gelişiminin daha derin anlaşılmasını ve rejeneratif tedaviler hakkında fikir verilmesini sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan in situ hibridizasyon yöntemi mezonephros gelişimini incelemeye yöneliktir. Bununla birlikte, metamorfoz sırasında bağırsak, sinir sistemi, ölçekler ve pigmentasyon gibi diğer doku ve organların gelişimini incelemek için uygulanabilir14. Endojen genler veya transgenik çizgilerdeki floresan belirteçler için problar oluşturulabilir.
Larvaların, organları ve dokuları kendi bağlamlarında gözlemlemek için bozulmadan kalmala…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pensilvanya Bilim Akademisi ve Pennsylvania Biyologlar Topluluğu ve Indiana University of Pennsylvania (Lisansüstü Çalışmalar ve Araştırma Okulu, Biyoloji Bölümü ve Cynthia Sushak Lisans BiyolojiSi Mükemmellik Fonu) tarafından finanse edildi. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı Dr. Neil Hukriede (Pittsburgh Üniversitesi) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
Referências
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish – emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al. Development of the zebrafish mesonephros. Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. . The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
