Multiplekset fluorescerende immunhiistokjemisk farging av fire endometrie immuncelletyper i tilbakevendende abort
Summary
Til tross for fremskrittene i multiplex immunhiistokjemi og multispektral avbildning, karakteriserer tettheten og klyngen av store immunceller samtidig i endometrium fortsatt en utfordring. Dette dokumentet beskriver en detaljert multipleksfargingsprotokoll og bildebehandling for samtidig lokalisering av fire immuncelletyper i endometriumet.
Abstract
Immunhiistokjemi er den mest brukte metoden for identifisering og visualisering av vevsantigener i biologisk forskning og klinisk diagnostikk. Den kan brukes til å karakterisere ulike biologiske prosesser eller patologier, for eksempel sårheling, immunrespons, vevsavvisning og vev-biomaterialer. Visualisering og kvantifisering av flere antigener (spesielt for immunceller) i en enkelt vevsseksjon ved hjelp av konvensjonell immunhiistokjemisk (IHC) farging forblir imidlertid utilfredsstillende. Derfor ble multipleksede teknologier introdusert de siste årene for å identifisere flere biologiske markører i en enkelt vevsprøve eller et ensemble av forskjellige vevsprøver.
Disse teknologiene kan være spesielt nyttige for å differensiere endringene i immuncelle-til-celle interaksjoner i endometrium mellom fruktbare kvinner og kvinner med tilbakevendende miscarriages under implantasjon. Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for multiplekset fluorescens IHC-farging for å undersøke tettheten og klyngen av fire store immuncelletyper samtidig i nøyaktig tidsbestemte endometrieprøver under embryoimplantasjon. Metoden inkluderer prøvepreparering, multipleksoptimalisering med markører for immuncelleundertyper, og skanning av lysbildene, etterfulgt av dataanalyse, med spesifikk referanse til å oppdage endometriale immunceller.
Ved hjelp av denne metoden kan tettheten og klyngen av fire store immuncelletyper i endometriumet analyseres samtidig i en enkelt vevsseksjon. I tillegg vil dette dokumentet diskutere de kritiske faktorene og feilsøkingen for å overvinne mulig fluoroforurensing mellom fluorescerende sonder som påføres. Det er viktig at resultatene fra denne multipleksfargingsteknikken kan bidra til å gi en grundig forståelse av immunologisk interaksjon og regulering under embryoimplantasjon.
Introduction
Tilbakevendende abort (RM) kan defineres som tap av to eller flere svangerskap før 24 ukers svangerskap1. Denne hyppige reproduktive tilstanden påvirker opptil 1% av par over hele verden2,3. Patofysiologien er multifaktoriell og kan deles inn i embryologisk drevne årsaker (hovedsakelig på grunn av en unormal embryonal karyotype) og maternalt drevne årsaker som påvirker endometrium og / eller placental utvikling. Denne manifestasjonen kan skyldes foreldregenetiske abnormiteter, livmoravvik, protrombotiske forhold, endokrinologifaktorer og immunologiske lidelser4.
I de senere år har immuneffektorcelledysfunksjon blitt involvert i patogenesen av tidlig graviditetstap5. Dette har inspirert mange undersøkelser om å belyse de spesifikke populasjonene av immunceller i endometrium under menstruasjonssyklusen, implantasjon og tidlig graviditet, med spesifikke roller i tidlig graviditet. Blant disse immuncellene spiller livmor naturlige morderceller (uNK) en kritisk rolle under embryoimplantasjon og graviditet, spesielt i prosessene for trofoblastisk invasjon og angiogenese6. Studier har vist en økt uNK celletetthet i endometrium av kvinner med RM7,8, selv om dette funnet ikke var forbundet med økt risiko for abort9. Dette stimulerte imidlertid forskning som evaluerte tettheten av andre immuncelletyper (som makrofager, livmor dendritiske celler) i endometrium hos kvinner med RM10,11. Likevel er det fortsatt usikkert om det er en betydelig endring i immuncelletettheten i peri-implantasjon endometrium hos kvinner med RM.
En mulig forklaring på usikkerheten er at evaluering av endometrial immuncelletetthet kan være vanskelig på grunn av de raske endringene i endometrium under implantasjonsvinduet. I løpet av 24 h tidsrammen, betydelige endringer i endometrium endre immuncelle tetthet og cytokin sekresjon, introdusere en kilde til variasjon i disse resultatene12. I tillegg er de fleste rapporter hovedsakelig avhengige av bruk av encellede farging (f.eks. tradisjonelle IHC-metoder) som ikke kunne undersøke flere markører på samme vevsseksjon. Selv om strømningscytometri kan brukes til å oppdage flere cellepopulasjoner i et enkelt utvalg, hindrer de store mengdene celler som kreves og den tidkrevende optimaliseringen populariteten og effektiviteten til denne metoden. Derfor kan det nylige fremskrittet i multiplex IHC-farging løse dette problemet ved å immunisere flere markører på samme lysbilde for å evaluere flere parametere, inkludert cellelinje og histologisk lokalisering av individuelle immununderbefolkninger. Videre kan denne teknologien maksimere informasjonen som er oppnådd i tilfelle begrenset vevstilgjengelighet. Til syvende og sist kan denne teknikken bidra til å belyse forskjellene i immuncelleinteraksjoner i endometriumet mellom fruktbare kvinner og kvinner med RM.
To grupper kvinner ble rekruttert fra Prince of Wales Hospital, inkludert fruktbare kontrollkvinner (FC) og kvinner med uforklarlig tilbakevendende abort (RM). Fruktbar kontroll ble definert som kvinner som hadde minst en levende fødsel uten noen historie med spontan abort, og RM-kvinner ble definert som de som hadde en historie med ≥2 påfølgende spontanaborter før 20 ukers svangerskap. Fagene fra de to gruppene oppfylte følgende inklusjonskriterier: (a) alder mellom 20 og 42 år, (b) ikke-røyker, (c) vanlig menstruasjonssyklus (25-35 dager) og normal livmorstruktur, (d) ingen bruk av hormonell regime i minst 3 måneder før endometrialbiopsi, (e) ingen hydrosalpinx ved hystero-salpingogram. I tillegg hadde alle de rekrutterte forsøkspersonene normalt karyotyping, normal 3-dimensjonal ultrasonografi hysterosalpingogram, dag 2 follikkelstimulerende hormon 30 nmol/l, normal skjoldbruskfunksjon og testet negativt for lupus antikoagulant og antikardiolipin IgG- og IgM-antikoagulant.
For bedre å forstå det immunologiske grunnlaget for RM, ville det være mest ønskelig å samtidig kvantifisere og lokalisere de store immuncelletypene som er tilstede i endometriumet på implantasjonstidspunktet. Dette dokumentet beskriver hele protokollen fra prøvepreparering, multipleksoptimalisering med markører for immuncelleundertyper og skanning av lysbildene, etterfulgt av dataanalyse med spesifikk referanse til å oppdage endometrie immunceller. Videre beskriver dette papiret hvordan du bestemmer tettheten og klyngen av immuncelletypene samtidig i endometriumet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Det er viktig å merke seg at multipleksfarging krever flittig optimalisering. Antigenuthenting, ved hjelp av sitratbuffer og mikrobølgeteknologi, krever optimalisering for å sikre fullstendig antistoffstriping og opprettholde vevs levedyktighet. Som TSA reagenser kovalent binder seg til steder rundt antigenet, kan de potensielt hemme bindingen av et påfølgende primært antistoff gjennom sterisk hindring (også kjent som “paraplyeffekten”). Dette har en tendens til å …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund i 2018 og Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
Referências
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
