Method Article

Coloração imunohistoquímica fluorescente multiplexada de quatro tipos de células imunes endometrial em aborto recorrente

DOI:

10.3791/62931

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August 4th, 2021

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1Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, Shenzhen Baoan Women’s and Children’s Hospital, Shenzhen University, 4School of Medicine, Faculty of Medicine and Health Sciences, Keele University, 5Li Ka Shing Institute of Health Sciences; School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong

In This Article

Summary

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Apesar dos avanços na imunohistoquímica multiplex e na imagem multiespectral, caracterizar a densidade e o agrupamento das principais células imunes simultaneamente no endométrio continua sendo um desafio. Este artigo descreve um protocolo detalhado de coloração multiplex e imagens para a localização simultânea de quatro tipos de células imunes no endométrio.

Abstract

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A imunohistoquímica é o método mais utilizado para identificação e visualização de antígenos teciduais em pesquisas biológicas e diagnósticos clínicos. Pode ser usado para caracterizar vários processos biológicos ou patologias, como cicatrização de feridas, resposta imune, rejeição tecidual e interações tecido-biomateriais. No entanto, a visualização e quantificação de múltiplos antígenos (especialmente para células imunes) em uma única seção tecidual usando a coloração imunohistoquímica convencional (IHC) permanece insatisfatória. Assim, tecnologias multiplexadas foram introduzidas nos últimos anos para identificar múltiplos marcadores biológicos em uma única amostra de tecido ou um conjunto de diferentes amostras de tecido.

Essas tecnologias podem ser especialmente úteis para diferenciar as mudanças nas interações célula-imune dentro do endométrio entre mulheres férteis e mulheres com abortos recorrentes durante a implantação. Este artigo descreve um protocolo detalhado para coloração de fluorescência multiplexada do IHC para investigar a densidade e o agrupamento de quatro tipos principais de células imunes simultaneamente em amostras endometrial precisamente cronometradas durante a implantação de embriões. O método inclui preparação amostral, otimização multiplex com marcadores para subtipos de células imunes e a varredura dos slides, seguido pela análise de dados, com referência específica à detecção de células imunes endometrial.

Usando este método, a densidade e o agrupamento de quatro tipos principais de células imunes no endométrio podem ser analisados simultaneamente em uma única seção tecidual. Além disso, este artigo discutirá os fatores críticos e a solução de problemas para superar possíveis interferências fluorforais entre as sondas fluorescentes que estão sendo aplicadas. É importante ressaltar que os resultados desta técnica de coloração multiplex podem ajudar a fornecer uma compreensão aprofundada da interação e regulação imunológica durante a implantação de embriões.

Introduction

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Aborto recorrente (RM) pode ser definido como a perda de duas ou mais gestações antes das 24 semanas de gestação1. Esta condição reprodutiva frequente afeta até 1% dos casais em todo o mundo2,3. A fisiopatologia é multifatorial e pode ser dividida em causas embriológicas (principalmente devido a um karyótipo embrionário anormal) e causas maternamente orientadas que afetam o desenvolvimento endométrio e/ou placentário. Essa manifestação pode resultar de anormalidades genéticas parentais, anomalias uterinas, condições protombolíticas, fatores de endocrinologia e distúrbios imunológicos

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Protocol

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O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica da Universidade Conjunta Chinesa de Hong Kong-Novos Territórios do Leste. O consentimento informado foi obtido dos participantes antes da coleta das biópsias endometrial. Consulte a seção de introdução para critérios de inclusão dos grupos de controle e RM.

1. Preparação da amostra

  1. Certifique-se de que todas as mulheres deste estudo se submetam a um teste diário de vareta de urina a partir do dia 9 do ciclo menstrual em diante para identificar o surto do hormônio luteinizador (LH) para detectar a ovulação, e cronometrar as biópsias endometrial precisamente no7º

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Results

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O processo esquemático global de realização de um ensaio multiplex de 4 cores para a detecção de 4 tipos de células imunes endometrial é mostrado na Figura 1. Resumindo, o protocolo para esta coloração de imunofluorescência multiplex exigiu 8 passos-chave: 1. Preparação de slides, 2. Recuperação de epitope, 3. Bloqueio, aplicação de anticorpos primários, 5. aplicação de anticorpos secundários, 6. Amplificação de sinal, 7. Remoção de anticorpos e 8. Contrastain e montagem. A renderização e an.......

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Discussion

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Passos críticos dentro do protocolo
É importante notar que a coloração multiplex requer otimização diligente. A recuperação de antígenos, usando a tecnologia de tampão citrato e micro-ondas, requer otimização para garantir a remoção completa de anticorpos e manter a viabilidade do tecido. Como os reagentes da TSA se ligam covalentemente aos locais ao redor do antígeno, eles podem potencialmente inibir a ligação de um anticorpo primário subsequente através de obstáculos estéricos (também conhecido como.......

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Disclosures

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Os autores declaram que não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgements

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Este estudo foi apoiado pelo Fundo Fiduciário Obstetra e Ginecológico de Hong Kong em 2018 e pelo Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Diluente de amplificaçãoPerkin ElmerFP1498Tampão diluente de fluoróforo
Diluente de anticorpoPerkin ElmerARD1001EADiluindo o anticorpo
CD3Spring BioscienceM3072Anticorpo primário
CD20Biocare MedicalCM004BAnticorpo primário
CD56LeicaNCL-CD56-504Primário anticorpo
CD68Spring BioscienceM5510Anticorpo primário
Citrato tampão Solução, pH 6,0 (10x)AbcamAB64214Solução de recuperação de antígeno
EMSURE Xileno (mistura isomérica)Merck108297Desparafinação
Etanol absolutoMerck107017Álcool etílico para reidratação
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica MicrótomoLeicaRM2125RTSSeccionamento de tecido embebido em parafina
inForm Software Avançado de Análise de ImagemPerkin ElmerinForm® Software Localizador de Tecidos 2.2.1 (versão 14.0)Software de Análise de Dados
Mantra® Estação de trabalho Akoya BiosciencesCLS140089Imagem espectral
MicroondasPanasonicInverterDecapagem de microondas
Opal 520Perkin ElmerFP1487AReagente fluorescente à base de tiramida apropriado
Opal 620Perkin ElmerFP1495AReagente fluorescente à base de tiramida apropriado
Opal 650Perkin ElmerFP1496AReagente fluorescente apropriado à base de tiramida
Opal 690Perkin ElmerFP1497AReagente fluorescente apropriado à base de tiramida
FornoMemmertU10
Solução de bloqueio de peroxidaseDAKOS2023Remoção das atividades da peroxidase tecidual
Lâmina revestida de poli-L-lisinaFISHER SCIENTIFIC120-550-15Lâmina para uso histológico de rotina
PolyHRP Broad SpectrumPerkin ElmerARH1001EAAnticorpo secundário
ProLong™ Gold Antifade MountantThemoFisher ScientificP36930Montagem
Spatstat/Versão 2.1-0Análise de padrão de ponto espacial
Spectral DAPIPerkin ElmerFP1490AColoração de ácido nucleico
Processador de tecidosThermo FischerExcelsior ESProcessamento de tecidos para desidratação e parafinação
Tris Buffer Saline (TBS), 10xTecnologia de Sinalização Celular12498SSolução de lavagem
Tween 20Sigma-AldrichP1370-1LDetergente não iônico
desparafinante

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004(2018).
  2. Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
  3. Rai, R., Regan, L.

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Multiplex ImmunohistochemistryFluorescent StainingEndometrial Immune CellsRecurrent MiscarriageImmune Cell ClusteringTissue SegmentationEpitope RetrievalAntibody LabelingCell CountingEmbryo Implantation

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