Optogenetisk fasövergång av TDP-43 i spinalmotoriska nervceller av zebrafisk larver
Summary
Vi beskriver ett protokoll för att inducera fas övergång av TAR DNA-bindande protein 43 (TDP-43) med ljus i spinal motor nervceller med zebrafisk som modell.
Abstract
Onormal protein aggregering och selektiv neuronal sårbarhet är två stora kännetecken för neurodegenerativa sjukdomar. Orsakssamband mellan dessa funktioner kan ifrågasättas genom att kontrollera fasövergången av ett sjukdomsassocierat protein i en sårbar celltyp, även om detta experimentella tillvägagångssätt har begränsats hittills. Här beskriver vi ett protokoll för att inducera fasövergång av RNA/DNA-bindande protein TDP-43 i spinal motor nervceller av zebrafish larver för modellering cytoplasmic aggregering av TDP-43 förekommer i degenererande motor nervceller i amyotrofisk laterala skleros (ALS). Vi beskriver en bakteriell konstgjord kromosom (BAC)-baserade genetisk metod för att leverera en optogenetic TDP-43 variant selektivt till spinal motor nervceller av zebrafish. Zebrafisklarvernas höga genomskinlighet möjliggör fasövergången av den optogenetiska TDP-43 i ryggradsmotoriska nervceller genom en enkel extern belysning med hjälp av en ljusemitterande diod (LED) mot ohämmad fisk. Vi presenterar också ett grundläggande arbetsflöde för live imaging av zebrafisk spinal motor nervceller och bildanalys med fritt tillgängliga Fiji / ImageJ programvara för att karakterisera svar av optogenetic TDP-43 till ljus belysningen. Detta protokoll möjliggör karakterisering av TDP-43 fas övergång och aggregerad bildning i en ALS-sårbar cellulär miljö, vilket bör underlätta en undersökning av dess cellulära och beteendemässiga konsekvenser.
Introduction
Ribonucleoprotein (RNP) granulat styr en myriad av cellulära aktiviteter i kärnan och cytoplasman genom att montera membranfria skiljeväggar via flytande-flytande fasseparation (LLPS), ett fenomen där en homogen vätska blandas till två distinkta vätskefaser1,2. Den dysreglerade LLPS av RNA-bindande proteiner som normalt fungerar som RNP granulatkomponenter främjar onormal fasövergång, vilket leder till proteinaggregering. Denna process har varit inblandad i neurodevelopmental och neurodegenerativa sjukdomar3,4,5. Den exakta utvärderingen av ett orsakssamband mellan avvikande LLPS av RNA-bindande proteiner och sjukdomspatogenes är avgörande för att avgöra om och hur LLPS kan utnyttjas som ett effektivt terapeutiskt mål. LLPS av RNA-bindande proteiner är relativt lätt att studera in vitro och i encelliga modeller men är svårt i multicellulära organismer, särskilt hos ryggradsdjur. Ett kritiskt krav för att analysera sådan LLPS i enskilda celler i en vävnadsmiljö är att stabilt uttrycka en sond för avbildning och manipulering av LLPS i en sjukdoms sårbar celltyp av intresse.
Amyotrofisk lateral skleros (ALS) är en ytterst dödlig neurologisk sjukdom där motoriska nervceller i hjärnan och ryggmärgen selektivt och gradvis förloras på grund av degeneration. Hittills har mutationer i mer än 25 gener associerats med ärftlig (eller familjär) form av ALS, som står för 5%-10% av de totala ALS-fallen, och några av dessa ALS-orsakande gener kodar RNA-bindande proteiner bestående av RNPs, såsom hnRNPA1, TDP-43 och FUS6,7. Dessutom kännetecknas den sporadiska formen av ALS, som står för 90-95% av de totala ALS-fallen, av den cytoplasmiska aggregeringen av TDP-43 deponeras i degenererande motoriska nervceller. En viktig egenskap hos dessa ALS-associerade RNA-bindande proteiner är deras inneboende oordnade regioner (IDR) eller områden med låg komplexitet som saknar ordnade tredimensionella strukturer och förmedlar svaga protein-proteininteraktioner med många olika proteiner som driver LLPS7,8. Det faktum att ALS-orsakande mutationer ofta förekommer i IDR har lett till tanken att avvikande LLPS och fasövergång av dessa ALS-relaterade proteiner kan ligga till grund för ALS patogenes9,10.
Nyligen utvecklades optoDroplet-metoden, en Cryptochrome 2-baserad optogenetisk teknik som möjliggör modulering av protein-proteininteraktioner med ljus, för att inducera fasövergång av proteiner med IDR11. Eftersom denna teknik har utvidgats framgångsrikt till TDP-43, har det börjat avslöja mekanismerna bakom patologisk fas övergång av TDP-43 och dess associerade cytotoxicitet12,13,14,15. I detta protokoll skisserar vi en genetisk metod för att leverera en optogenetisk TDP-43 till ALS-sårbara celltyper, nämligen spinal motor nervceller i zebrafisk med hjälp av BAC för mnr2b/mnx2b genen kodar ett homeodomain protein för motor neuron specifikation16,17. Zebrafisklarvernas höga genomskinlighet möjliggör enkel, icke-invasiv ljusstimulering av den optogenetiska TDP-43 som utlöser dess fasövergång i ryggradsmotoriska nervceller. Vi presenterar också ett grundläggande arbetsflöde för live imaging av zebrafisk spinal motor nervceller och bildanalys med hjälp av den fritt tillgängliga Fiji / ImageJ programvara för att karakterisera svaren av optogenetic TDP-43 till ljusstimulering. Dessa metoder möjliggör en undersökning av TDP-43 fas övergång i en ALS-sårbar cellulär miljö och bör bidra till att utforska dess patologiska konsekvenser på cellulära och beteendemässiga nivåer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mnr2b-BAC-medierat uttryck för opTDP-43h och EGFP-TDP-43z i zebrafisk ger en unik möjlighet till levande avbildning av TDP-43 fas övergång i spinal motor nervceller. Den optiska transparensen i kroppsvävnader av zebrafisk larver möjliggör enkel och icke-invasiv optogenetisk stimulering av opTDP-43h. Jämförelser mellan en spinal motor nervceller över tiden visade att den ljusberoende oligomerization av opTDP-43h orsakar dess cytoplasmic kluster, som påminner om ALS patologi.
<p class="jove_content"…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numbers JP19K06933 (KA) och JP20H05345 (KA).
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
Referências
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
- Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
- Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
- Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
- Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
- Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
- Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
- Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
- Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
- Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Biologia do Desenvolvimento. 268 (2), 372-383 (2004).
- Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
- Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).
